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Ensayos de esterilidad
El término esterilización puede definirse como el conjunto de operaciones destinadas a eliminar todos los microorganismos presentes en un objeto o sustancia. Por tanto, dicho objeto o sustancia estará estéril cuando se demuestre la ausencia absoluta de toda forma viable de vida, no existiendo grados de esterilidad.
Los ensayos de esterilidad se aplican a todos los productos biológicos, medicamentos, material quirúrgico, etc., que deben estar estériles. Tienen como finalidad la detección de formas viables de microorganismos, en medios de cultivo adecuados, que actúan como contaminantes en productos estériles (bacterias, hongos, levaduras). Con respecto a los medicamentos, el objetivo del ensayo de esterilidad (aplicado a los medicamentos estériles) es proporcionar un control independiente para comprobar que un producto cumple con las exigencias de la Farmacopea Europea.
Las instalaciones para el ensayo de esterilidad tienen requisitos ambientales específicos para asegurar la integridad de los ensayos realizados. Las buenas prácticas de fabricación (BPF) de la OMS para productos farmacéuticos estériles requieren la ejecución del ensayo de esterilidad y especifican los requisitos para el mismo.
El ensayo de esterilidad se debe realizar bajo condiciones asépticas, las cuales deben ser equivalentes a las normas de calidad de aire requeridas para la fabricación aséptica de productos farmacéuticos. Las dependencias, servicios y equipos deben estar sujetos a un proceso de calificación apropiado. El personal que realice ensayos debe tener entrenamiento específico en manejo de equipos y técnicas básicas.
El ensayo de esterilidad se debe llevar a cabo dentro de una zona protegida con flujo de aire (filtrado a través de filtros HEPA) unidireccional de grado A o una cabina de bioseguridad o, alternativamente, dentro de un aislador en un entorno de grado B.
Consideraciones previas con respecto a la determinación de la esterilidad de formas farmacéuticas estériles:
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en condiciones óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Es importante tener en cuenta la composición, preparación, conservación y fin del medio a utilizar para asegurar que los resultados obtenidos sean confiables y reproducibles.
Las buenas prácticas de la OMS describen dos medios de cultivo empleados en las pruebas de esterilidad:
a) Medio fluido Tioglicolato (FTG): excelente medio para la detección de contaminación bacteriana; se utiliza fundamentalmente para el cultivo de bacterias anaeróbicas.
b) Medio fluido tripticasa de soja (TSB): medio universal, sin inhibidores ni indicadores. Apto para el crecimiento de microorganismos exigentes por aportar una gran base nutritiva. Adecuado para el cultivo de hongos y bacterias aeróbicas
- Esterilidad del medio de cultivo
Es necesario verificar la esterilidad del producto incubando una muestra del mismo a la temperatura correspondiente a cada medio, durante 14 días, o incubando un recipiente con medio no inoculado como control negativo en paralelo al ensayo de esterilidad.
Esta prueba se fundamenta en detectar cualquier tipo de microorganismo como hongos, levaduras, bacterias oportunistas, bacterias patógenas, etc., que se presenten en una forma farmacéutica estéril.
Los medios de cultivo deben someterse a una prueba de promoción de crecimiento, donde se evidencia la capacidad del medio para cumplir con todas las exigencias nutricionales que pueda demandar el desarrollo de los microorganismos.
Antes de efectuar un ensayo de esterilidad en un producto, se deberá demostrar la ausencia de actividad bacteriostática y fungistática del mismo. El ensayo de aptitud deberá efectuarse cada vez que se cambia alguna condición del ensayo o cuando exista un cambio significativo en la composición del producto.
Este ensayo se realiza por dos métodos explicados más adelante: método de filtración por membrana y método de inoculación directa.
1. Técnicas para la prueba de esterilidad
1.1 Inoculación directa
En esta técnica, empleada fundamentalmente con productos farmacéuticos no filtrables, se transfiere directamente una cantidad apropiada de la muestra a los medios de cultivo destinados a la detección de bacterias aerobias y anaerobias (tioglicolato) así como a los medios de detección de hongos y levaduras (tripticasa de soja). Debe realizarse de forma aséptica. La cantidad de producto examinado no debe ser mayor del 10% con respecto al volumen del medio.
- Puede evaluarse el contenido total de los productos, lo que supone una ventaja en aquellos de gran volumen (se incrementa la capacidad para la detección de contaminantes).
- Bajos niveles de contaminación pueden concentrarse en la membrana por filtración de un alto volumen de producto.
- Los organismos presentes en un producto oleoso pueden separarse durante la filtración y ser suspendidos en un medio acuoso más adecuado.
Como desventajas (las cuales son inexistentes en los actuales equipos de filtración, y que son completamente cerrados), cabe mencionar:
- Existe una alta probabilidad de contaminación debido a las operaciones manuales como el ensamblaje del equipo de filtración o el corte de la membrana y su posterior transferencia a los medios.
- Resulta complejo identificar la fuente de contaminación, que puede estar presente en la filtración, en la membrana o en el medio de cultivo.
1.3 Lisado de Amebocitos de Limulus (LAL)
Esta técnica se emplea fundamentalmente en la industria farmacéutica para asegurar la ausencia de pirógenos (sustancias que producen fiebre) en los productos terminados parenterales. Entre la gran variedad de pirógenos existentes, se asume que las endotoxinas son los más relevantes en los preparados farmacéuticos. El LAL es un método in vitro que detecta con alta sensibilidad la presencia de endotoxinas bacterianas. Aparte de en la industria farmacéutica, también se emplea en laboratorios de biología y biomedicina, en control de calidad de medios susceptibles de estar contaminados con endotoxinas bacterianas (alimentos, aguas). Así mismo, resulta clave en la industria cosmética y en la elaboración de alimentos, siendo el método aconsejado por la FDA para la detección de pirógenos.
Las endotoxinas son compuestos químicos complejos que se encuentran exclusivamente en la membrana externa de la pared celular de las bacterias Gram- negativas.
Experimentalmente, se ha comprobado que los elementos responsables de la coagulación intravascular del cangrejo Limulus por acción de las endotoxinas son de naturaleza enzimática, y se encuentran dentro de los amebocitos, único tipo de células presentes en la hemolinfa azul de dicho cangrejo. El reactivo LAL es un extracto acuoso de los amebocitos, compuesto por una cascada de enzimas serino proteasas tipo tripsina capaz de reaccionar frente a pequeñas cantidades de endotoxinas.
El ensayo LAL solo es válido para la detección de endotoxinas; la realización del mismo solo conduce a la confirmación de medio libre de pirógenos cuando está
acompañado de otros análisis y medidas sanitarias específicas para erradicar el resto de microorganismos contaminantes.
Para el uso del ensayo LAL debe realizarse una validación para el proceso industrial específico en el que se va a aplicar. Estas validaciones vienen reguladas por la FDA.
Existen 3 variaciones básicas del ensayo LAL en el mercado: método de gelificación o GEL-CLOT, cromogénicos y turbidimétricos.
1.3.1 Método de gelificación (GEL-CLOT)
Es el ensayo clásico y el más elemental entre los métodos del LAL. La reacción desarrollada en el tubo de ensayo es esencialmente la misma que ocurre in vivo en la hemolinfa del cangrejo Limulus frente a las endotoxinas. Es el ensayo menos susceptible a inhibición y requiere de un equipamiento más sencillo y menos costoso.
La presencia de endotoxinas es determinada por la formación de un gel o coágulo insoluble (coagulación de las proteínas por acción de las endotoxinas). Puede desarrollarse de manera cualitativa (dando resultados binarios, positivo si el gel permanece intacto al invertir el tubo de ensayo, y negativo para cualquier otra condición) y semicuantitativa (ensayo límite). El alcance del método está limitado únicamente por la sensibilidad del lisado; no se pueden cuantificar endotoxinas por debajo del nivel (sensibilidad) al cual se forma un gel sólido.
1.3.2 Métodos cromogénicos
Estos métodos se fundamentan en el empleo de un sustrato cromogénico sintético incoloro, compuesto por un pequeño péptido unido a una molécula del cromóforo p-nitroanilina (pNA). Una vez activada la cascada del LAL, la enzima coaguladora provoca la liberación de la molécula de pNA, de color amarillo. El desarrollo de la coloración amarilla es proporcional a la concentración de endotoxinas en la muestra (determinación por espectrofotometría UV-VIS).
El uso de sustratos cromogénicos, comparando con el método de gelificación, disminuye el tiempo del ensayo, elimina la posible destrucción accidental del gel durante la incubación o la lectura, y permite una mayor capacidad de procesamiento de muestras.
Existen dos variantes del método:
- Método cromogénico cinético
Se basa en la medida del desarrollo de color en el tiempo de la disolución objeto de estudio, tras la adición del reactivo de LAL que contiene el sustrato cromogénico.
Las ventajas de este método son varias, como la posibilidad de total automatización, la medición de gran cantidad de muestras en un corto período de tiempo y el sencillo procesamiento de los resultados. La desventaja principal es que muchas sustancias
- Método turbidimétrico cinético
Se realizan medidas de la turbidez a diferentes tiempos. Posee el más amplio rango de detección (con un bajo límite de detección) entre todos los métodos conocidos. Su principal desventaja es que requiere de un equipamiento costoso y de un personal lo suficientemente calificado para el manejo de equipos y el procesamiento de los datos.
Actualmente, es el método más empleado, gracias a que los adelantos tecnológicos han posibilitado acoplar lectores de placas multimedidas, con control de la temperatura y la informatización completa del proceso de recogida de datos.
- Método turbidimétrico de punto final
Raramente se emplea en la actualidad. El principal inconveniente de este ensayo es que requiere un control muy cuidadoso del tiempo de incubación y lectura; la reacción no se detiene, con lo que el desarrollo de la turbidez continúa. Las muestras podrán leerse a un tiempo fijo y solo una vez.
Anexo: Turbidimetría y Nefelometría
Los sistemas para la medición de turbidez operan sobre la base de los fenómenos ópticos que se producen al incidir un haz de luz a través de un medio. La turbidez se define como la reducción de la transparencia de un líquido causada por la presencia de partículas no disueltas de material distinto al propio líquido (ISO). Al ser un indicador de apariencia óptica, ocasionado por la dispersión y absorción de la energía lumínica a través del medio, la turbidez solo puede ser medida usando técnicas ópticas (espectrofotométricas). Se fundamenta en la relación de la intensidad de la luz incidente y de la luz dispersada por el medio, mediante la ley de Lambert-Beer, en la que la turbidez es proporcional a la concentración de partículas.
La turbidez se mide utilizando las técnicas de turbidimetría o nefelometría. La relación directa entre los datos de turbidez y la concentración de sólidos suspendidos depende de muchos factores, entre los cuales se incluye el tamaño de las partículas, la forma, la distribución y el estado de la superficie, índice de refracción de las partículas de dispersión y de la longitud de onda de la luz utilizada.
Hay tres diseños básicos de medidores de turbidez:
- El nefelómetro cuantifica la intensidad de la luz dispersada por la muestra bajo análisis. El sensor se encuentra montado en un ángulo normalmente de 90º con respecto al rayo de luz incidente. Este diseño tiene una precisión limitada a elevadas turbiedades. A medida que aumenta la turbidez aumenta la cantidad de luz dispersa, ocurriendo una dispersión múltiple que disminuye la intensidad de luz difusa que llega al detector situado a los 90º.
- El turbidímetro que mide la absorbancia de la muestra en estudio. Es uno de los instrumentos más utilizados y la técnica empleada consiste en el uso de un cultivo de microorganismos en un medio líquido, que actúa como suspensión coloidal, la cual bloquea y refleja la luz que pasa a través de él. La luz es absorbida de manera directamente proporcional a la concentración de células que hay en el cultivo.
- El turbidímetro que revela la tasa o relación de intensidades luminosas; mide tanto la transmisión de la intensidad de la luz como su dispersión. Este diseño es muy apropiado para los productos líquidos que presenten colores intensos y para muestras de gran turbidez. Esta configuración es la clave para obtener buenas características de rendimiento en las mediciones de turbidez, así como una buena estabilidad, linealidad, sensibilidad, baja luz difusa y rechazo del color.
Los métodos turbidimétricos son ampliamente aplicados en biotecnología, bioquímica y farmacia: estimación del crecimiento bacteriano en procesos fermentativos, medición de sensibilidad de antibióticos en bacteriología, determinación de proteínas totales, etc. Una de las aplicaciones más frecuentes de la nefelometría es la detección de las reacciones antígeno-anticuerpo (estos complejos, debido a su tamaño, son capaces de dispersar la luz).
Los recuentos microscópicos directos permiten determinar el número de células microbianas, por observación directa en el microscopio. Presentan una gran ventaja, ya que la muestra puede utilizarse tal cual diluciones de la misma.
Técnicas de recuento:
- Siembra en profundidad : consiste en añadir medio de cultivo fundido y enfriado a 50ºC sobre una placa de Petri que contiene una cantidad determinada de la muestra diluida. Se tapa la placa y se rota para mezclar la muestra en el agar. Cuando el agar solidifica se incuban las placas. Las colonias se desarrollan tanto dentro del agar como en la superficie. Es un método generalmente utilizado para el recuento de microorganismos anaerobios facultativos o microaerófilos.
- Siembra en superficie : consiste en la siembra de un volumen conocido de la dilución de la muestra sobre la superficie de un medio de cultivo en placa Petri. En este método todas las colonias crecen sobre la superficie del medio. Generalmente se utiliza esta técnica para el recuento de bacterias aerobias.
- Filtración por membrana : se emplean filtros de membrana con tamaño de poro no mayor de 0.45 μm. Se elige el material de la membrana tal que la eficiencia de la retención microbiana no sea afectada por los componentes de la muestra. Se transfiere la cantidad apropiada de la dilución de la muestra a la membrana y se filtra. Tras lavar el filtro adecuadamente, se transfiere la membrana a las placas Petri con los medios de cultivo. Las placas se invierten y se incuban.
- Tubos múltiples (Método del Número Más Probable - NMP) : consiste en realizar diluciones decimales en serie de la muestra en un medio de cultivo adecuado. Los tubos de ensayo con los cultivos se incuban y, posteriormente, se examinan para detectar turbidez.
1.2 Recuento combinado de hongos filamentosos y levaduras
- Siembra en profundidad
- Siembra en superficie
- Filtración por membrana
1.3 Resultados e interpretación
Contar el número de colonias y expresar el promedio de los duplicados de las placas como el número de unidades formadoras de colonias por g (ufc/g) o por ml de muestra (ufc/ml).
1.4 Control negativo
Se recomienda para verificar las condiciones del ensayo realizar en paralelo un control negativo replicando el procedimiento en ausencia de muestra. No debe observarse crecimiento de microorganismos. Es necesario investigar cualquier falla en este control.
1.5 Criterios de aceptación
Los productos farmacéuticos pueden ser vehículos de microorganismos que pueden producir enfermedades, alteraciones físico-químicas, disminución de la actividad terapéutica o ser indicadores de calidad higiénica deficiente. Deben, por lo tanto, fijarse límites de aceptabilidad con el fin de garantizar la inocuidad y estabilidad del producto desde el punto de vista microbiológico. Los límites de aceptabilidad, de acuerdo a la vía de administración, deben interpretarse como:
- 10^1 ufc significa que el recuento máximo aceptable es 20.
- 10^2 ufc significa que el recuento máximo aceptable es 200.
- 10^3 ufc significa que el recuento máximo aceptable es 2000.
