Enzimas

Prácticas de Bioquímica Mgr. Soledad Bornás Acosta

________________________________________________________________________________

PRACTICA 6

ENZIMAS

1. INTRODUCCION

Las enzimas son sustancias de naturaleza proteica, que modifican la velocidad de las

reacciones químicas dentro del organismo, esta acción se como biocatálisis o cinética

enzimática.

La actividad de una enzima es eficiente en pequeñas concentraciones y altamente

específicas. Algunas enzimas dependen para su actividad solamente de su estructura

proteica y otras dependen de estructuras no proteicas llamados cofactores enzimáticos. El

cofactor puede ser un ión metálico (ejemplo Fe++, Mg++, Ca++, k+, Na+, etc.) o puede ser una

molécula orgánica llamada coenzima (ejemplo NAD, FAD, FMN, ácido lipoico, etc.).

Existen cuatro factores (temperatura, pH, concentración de sustrato y enzima) que pueden

regular la actividad de la enzima proteolítica llamada pepsina, la cual es secretada por las

células principales del estómago, en forma de zimógeno o proenzima llamado pepsinógeno.

Como sustrato se considera a la ovoalbúmina, la cual es una proteína globular presente en

la clara de huevo a elevadas concentraciones. Esta proteína es su estado natural mide

13x3nm y está constituida por 584 residuos de aminoácidos agrupados en una sola cadena

y con un PM de 64000 y un pI de 4,6.

La ovoalbúmina debe ser desnaturalizada previamente para su uso; esto se consigue

sometiendo al huevo a ebullición se extrae la clara y se licua con agua destilada y esta

solución se filtra a través de una gasa, obteniéndose así una solución turbia y su aclaración

será producto de la degradación de la ovoalbúmina por la pepsina.

2. OBJETIVOS

• Determinar la acción hidrolítica de la pepsina sobre la ovoalbúmina desnaturalizada.

• Estudiar los cuatro factores influyentes sobre la actividad enzimática de la pepsina.

• Evaluar la actividad enzimática a través de la formación del producto.

3. MATERIAL Y METODOS

3.1. MATERIALES

3.1.1. Materiales biológicos

• Ovoalbúmina 1%

3.1.2. Materiales de vidrio

• Tubos de ensayo

• Pipetas

• Cubetas

• Vasos de precipitación

• matraces

3.1.3. Reactivos

• HCl 1N

• Na2CO3 10%

• Pepsina 1%

• Agua destilada

3.1.4. Equipos y otros

• Espectrofotómetro

• Piseta

• Baño María

• Cocina

Vista previa parcial del texto

¡Descarga Enzimas - práctica 8 y más Apuntes en PDF de Bioquímica solo en Docsity!

________________________________________________________________________________

PRACTICA 6

1. INTRODUCCION

Las enzimas son sustancias de naturaleza proteica, que modifican la velocidad de las reacciones químicas dentro del organismo, esta acción se como biocatálisis o cinética enzimática. La actividad de una enzima es eficiente en pequeñas concentraciones y altamente específicas. Algunas enzimas dependen para su actividad solamente de su estructura proteica y otras dependen de estructuras no proteicas llamados cofactores enzimáticos. El cofactor puede ser un ión metálico (ejemplo Fe++, Mg++, Ca++, k+, Na+, etc.) o puede ser una molécula orgánica llamada coenzima (ejemplo NAD, FAD, FMN, ácido lipoico, etc.). Existen cuatro factores (temperatura, pH, concentración de sustrato y enzima) que pueden regular la actividad de la enzima proteolítica llamada pepsina, la cual es secretada por las células principales del estómago, en forma de zimógeno o proenzima llamado pepsinógeno. Como sustrato se considera a la ovoalbúmina, la cual es una proteína globular presente en la clara de huevo a elevadas concentraciones. Esta proteína es su estado natural mide 13x3nm y está constituida por 584 residuos de aminoácidos agrupados en una sola cadena y con un PM de 64000 y un pI de 4,6. La ovoalbúmina debe ser desnaturalizada previamente para su uso; esto se consigue sometiendo al huevo a ebullición se extrae la clara y se licua con agua destilada y esta solución se filtra a través de una gasa, obteniéndose así una solución turbia y su aclaración será producto de la degradación de la ovoalbúmina por la pepsina.

2. OBJETIVOS - Determinar la acción hidrolítica de la pepsina sobre la ovoalbúmina desnaturalizada. - Estudiar los cuatro factores influyentes sobre la actividad enzimática de la pepsina. - Evaluar la actividad enzimática a través de la formación del producto. 3. MATERIAL Y METODOS 3.1. MATERIALES 3.1. 1. Materiales biológicos - Ovoalbúmina 1% 3.1.2. Materiales de vidrio - Tubos de ensayo - Pipetas - Cubetas - Vasos de precipitación - matraces 3.1. 3. Reactivos - HCl 1N - Na 2 CO 3 10% - Pepsina 1% - Agua destilada 3.1.4. Equipos y otros - Espectrofotómetro - Piseta - Baño María - Cocina

________________________________________________________________________________

Termómetro 3.2. METODOS Mediante la observación y exploración se aplicará el método de solubilidad, el método de absorción utilizando el espectrofotómetro para determinar el comportamiento y concentración de una enzima. 4. PROCEDIMIENTO 4.1. Efecto del pH sobre la actividad enzimática
Preparar cinco sistemas de tubos de la siguiente manera: 1 2 3 4 5 Ovoalbúmina 1% 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2,5mL HCl 1% 1mL 0,25mL Agua destilada 0,75mL 1mL 0,75mL Na 2 CO 3 10% 0,25mL 1mL Pre-Incubar x 5 minutos 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C Pepsina 1% 1,5mL 1,5mL 1,5mL 1,5mL 1,5mL Incubar x 5 minutos 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C
Nota: Antes de pre-Incubar e incubar mezclar bien cada sistema. 4.2. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática
Preparar cinco sistemas de tubos de la siguiente manera: 1 2 3 4 5 Ovoalbúmina 1% 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2,5mL HCl 1% 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25% 0,25mL Agua destilada 1,75mL 1 ,75mL 1 ,75mL 1 ,75mL 1,75mL Pre-Incubar x 5minutos 0°C 20°C 37°C 60°C 90°C Pepsina 1% 0 ,5mL 0 ,5mL 0 ,5mL 0 ,5mL 0 ,5mL Incubar 0°C 20°C 37°C 60°C 90°C
Nota: Antes de pre-Incubar e incubar mezclar bien cada sistema. 4.3. Efecto de la concentración de la enzima sobre la actividad enzimática
Preparar cinco sistemas de tubos de la siguiente manera: 1 2 3 4 5 Ovoalbúmina 1% 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2,5mL HCl 1% 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25mL Agua destilada 2,25mL 2,00mL 1 ,75mL 1 , 2 5mL 0,75mL Pepsina 1% 0mL 0,25mL 0,50mL 1,00mL 1,50mL Incubar x 5 minutos 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C
Nota: Antes de incubar mezclar bien cada sistema. 4.4. Efecto de la concentración del sustrato sobre la actividad enzimática
Preparar cinco sistemas de tubos de la siguiente manera: 1 2 3 4 5 Ovoalbúmina 1% 1,0mL 1,5mL 2,0mL 2,5mL 3,0mL HCl 1% 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25mL Agua destilada 3,5mL 3,0mL 2,5mL 2,0mL 1,5mL Lectura de Absorbancia 1 Pre-Incubar x 5 minutos 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C Pepsina 1% 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25mL Incubar x 5 minutos 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C Lectura de Absorbancia 2

________________________________________________________________________________

7. CUESTIONARIO

7.1. ¿Qué es un zimógeno, cite al menos cuatro ejemplos? 7.2. ¿Cuáles son las formas de evaluar la actividad enzimática? 7.3. Determinar el km gráfica o teóricamente, teniendo en cuenta la Vmáx. 7.4. ¿Cómo influye los factores de pH, temperatura, concentración de enzima y sustrato sobre la actividad enzimática de la pepsina? 7.5. ¿Cómo será la actividad enzimática de la pepsina al nivel del pH del jugo gástrico?

8. BIBLIOGRAFIA

Enzimas - práctica 8, Apuntes de Bioquímica

Documentos relacionados

Vista previa parcial del texto

¡Descarga Enzimas - práctica 8 y más Apuntes en PDF de Bioquímica solo en Docsity!

________________________________________________________________________________

PRACTICA 6

ENZIMAS

1. INTRODUCCION

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

7. CUESTIONARIO