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Repaso del equilibrio químico 7.51 Septiembre, 1999
Los experimentos sobre el equilibrio estudian cómo la concentración de los productos de la reacción varía en función de la concentración de los reactivos y/o de las condiciones de la reacción. Para una típica reacción bimolecular en equilibrio, como por ejemplo, A + B ⇔ AB, se podría valorar una cantidad establecida del reactivo [B] con cantidades cada vez mayores del reactivo [A] y determinar, así, la concentración de equilibrio del producto [AB].
La forma de la curva de equilibrio depende del mecanismo de reacción y se puede emplear para elegir entre distintos modelos de equilibrio.
Constantes de equilibrio
Una constante de equilibrio , representada por K (mayúscula), es la relación existente entre las concentraciones en equilibrio de reactivos y productos o viceversa.
Para la reacción bimolecular A + B ⇔ AB, podemos definir una constante de
disociación en el equilibrio (Kd) y otra de asociación (Ka ), relacionadas entre sí del siguiente modo:
En las reacciones bimoleculares, las unidades de Kd son unidades de concentración (M,
mM, μM, etc.) y las de Ka , son las de concentración -1^ (M -1^ , mM -1^ , μM -1^ , etc.).
Para una reacción unimolecular de plegamiento de proteína D ⇔ N, podemos definir una constante de desplegamiento en el equilibrio (KD) o una de plegamiento (KN), ambas relacionadas entre sí:
Estas constantes de equilibrio, al igual que todas las de las reacciones unimoleculares, carecen de unidades.
Para cualquier expresión de equilibrio, el sentido en el que tiene lugar la reacción (es decir, disociación frente a asociación o plegamiento frente a desplegamiento) va desde las especies moleculares situadas a la derecha de la expresión en la parte inferior, hacia las que se encuentran sobre ellas.
Las constantes de equilibrio de una reacción del tipo: nA + mB ⇔ An Bm, son:
El valor de cualquier constante de equilibrio sólo será constante para una determinada temperatura, presión, etc. De este modo, las constantes de equilibrio de una misma reacción a distintas temperaturas (p. ej., a 20 °C y 37 °C) podrían ser muy distintas.
¿Por qué las reacciones alcanzan un equilibrio?
Independientemente del mecanismo, todas las reacciones reversibles alcanzan una distribución en equilibrio de reactivos y productos cuando la velocidad de las reacciones que tienen lugar en ambos sentidos se iguala.
Estudiar la velocidad global a la que varía [AB] en la reacción A + B ⇔ AB.
Si iniciamos la reacción mezclando A y B libres, la velocidad de asociación
(kasoc [A][B]) dominará la reacción y la de disociación (-kdis[AB]) será menor, ya que habrá muy poca cantidad del complejo AB. Sin embargo, a medida que se forman más complejos, la velocidad de asociación tenderá a disminuir y la de disociación aumentará, debido a que las concentraciones de [A] y [B] irán disminuyendo, mientras aumenta la de [AB]. En algún momento, las velocidades de las reacciones en ambos
La relación matemática existente entre la fracción de B enlazada y la concentración libre de [A], es clara.
Fracción de B enlazada
Esta es la ecuación de una hipérbola rectangular; con frecuencia, las curvas de enlace bimoleculares reciben el nombre de curvas de enlace hiperbólicas.
La fracción de B enlazada se representa, a menudo, como , de modo que:
A partir de esta expresión es fácil deducir que, si [A] = Kd, = 0,5. Así, la mitad del número máximo de enlaces de B se alcanza cuando la concentración de A libre es igual
a Kd. De este modo, resulta sencillo calcular Kd sólo con estudiar la curva de enlace. A continuación se muestran los mismos datos de enlace, pero representados frente a log[A].
En cualquier reacción bimolecular, el 10% de B estará enlazado cuando [A] = K (^) d/9 y el
90% de B, cuando [A] = 9Kd. Esto quiere decir que el 80% de la reacción de enlace tiene lugar por encima de un rango de concentración de alrededor de 80 en [A], con el
centro en torno a Kd.
Los datos del enlace bimolecular se pueden transformar también en una forma lineal para representarlos según la ecuación de Scatchard.
De este modo, representando gráficamente como función de , deberíamos
obtener una línea recta con una pendiente de –1/Kd. En la gráfica de Scatchard que se muestra a continuación se representan los mismos datos utilizados en anteriores las curvas de enlace.
En este caso, se pueden calcular las constantes de equilibrio (KD) del desplegamiento de la proteína para cada una de las concentraciones de urea, de 2 a 4,5M aproximadamente, donde hay presentes concentraciones apreciables de la proteína tanto plegada como desplegada. Por ejemplo, a una concentración de urea 3M, las cantidades de proteína nativa y desnaturalizada son iguales y, de ese modo, KD = 1. Sin embargo, para calcular el valor de KD sin la presencia de urea o a una concentración de urea 8M, necesitaríamos un modelo sobre el modo en el que KD varía en función de la concentración de ésta. Por lo general, se observa que el ln KD varía linealmente con respecto a la concentración de urea, permitiendo el cálculo de KD en ausencia de ella.
Problemas frecuentes al calcular las constantes de equilibrio
Hay varios errores frecuentes que nos pueden llevar a un cálculo incorrecto de las constantes de equilibrio:
(1) Utilizar concentraciones de especies que no sean concentraciones de equilibrio. Cualquier experimento de equilibrio tiene un componente cinético. Una vez que se inicia la reacción hay que esperar una cierta cantidad de tiempo antes de medir los productos. Si este tiempo es muy corto, puede que las concentraciones de reactivos y productos estén cambiando todavía. Una buena forma de comprobar si la reacción ha alcanzado o no el equilibrio es ver si la etapa final a la que se ha llegado es la misma independientemente de que se haya iniciado la reacción añadiendo reactivos o productos.
(2) Emplear concentraciones totales en lugar de concentraciones libres en la expresión de equilibrio.
(3) Utilizar un modelo de equilibrio erróneo. El cociente [A][B]/[AB] sólo será constante en equilibrio para el modelo A + B ⇔ AB.
Reacciones que producen cambios en la forma oligomérica
Las proteínas oligoméricas son muy frecuentes en biología. Supongamos una reacción en la que dos moléculas de A libre se combinen con B para formar un complejo A2B sin intermediarios detectables.
Para calcular Kd, cuyas unidades en esta reacción son M 2 , valoramos una cantidad fija de [B] con cantidades en aumento de [A] y medimos la fracción de B enlazada. La ecuación que relaciona la fracción de [B] enlazado con [A] para este modelo de equilibrio es la siguiente:
Fracción de B enlazada
La curva de enlace de este modelo de equilibrio presenta una forma de S o sigmoidea como la que se puede ver a continuación:
Obsérvese también que Kd = [A] 2 cuando la mitad de B disponible está enlazada. La representación de estos datos en una escala logarítmica destaca que la curva de enlace tiene una pendiente mucho más pronunciada que en el caso A + B ⇔ AB simple. Ahora, el 90% de la reacción de enlace tiene lugar en un rango de concentración de [A] de orden 9 con el centro próximo a la mitad del número de enlaces máximos.
Los enlaces en sistemas cooperativos con grandes cambios en el proceso oligomérico pueden ser extraordinariamente sensibles a pequeños cambios en la concentración del ligando.
Los procesos intermedios en las reacciones de equilibrio
Es raro que los complejos que contienen tres o más moléculas se formen en una sola etapa en la que colisionen todas las moléculas simultáneamente. Por lo general, es mucho más probable que dichas reacciones se desarrollen mediante sucesivas
reacciones bimoleculares. En la reacción 2A + B ⇔ A2B, A podría dimerizarse primero y luego unirse a B. Otra opción sería que una sola molécula de A pudiera unirse a B en una etapa, y que la segunda molécula de A se les uniera en otra etapa. Estas reacciones se escribirían del siguiente modo:
Y, en el siguiente diagrama, se muestran de forma esquemática para una proteína enlazante de ADN:
Cualquiera de los dos caminos de formación consiste en dos equilibrios combinados. En cualquier conjunto de procesos combinados, cada etapa afecta a su adyacente únicamente cambiando la concentración de un participante común mediante la acción de
masas. Si examinamos el camino superior K1K2, los procesos combinados serán:
AB es la especie más frecuente en los equilibrios K 1 y K2. Así, al aumentar las
concentraciones de [A] libre o de [B] en la reacción K1, se produciría un aumento en la concentración de [AB]. Esto, a su vez, tendría como resultado una mayor concentración
de A2B en la reacción K (^) 2. Cómo se muestra a continuación, A 2 es la especie molecular
más frecuente en las reacciones K 3 y K4.
Obsérvese que el producto de las constantes de equilibrio de las etapas K 1 y K 2 es igual
al de las constantes de equilibrio de las etapas K 3 y K4; y que ambos productos nos dan la constante de equilibrio de la reacción global.
Si, por el contrario, los intermediarios se encuentran bastante concentrados y el
experimento no puede distinguir entre AB y A2B, ambas especies tendrían que incluir el
cálculo de , la fracción de B enlazada.
Equilibrios que incluyen componentes tampón
Es frecuente ensayar el enlace de dos macromoléculas o de un ligando pequeño y una macromolécula en una disolución tampón que contiene componentes que, en principio, podrían participar en la reacción. Suponer, por ejemplo, que dos iones cloruro se enlazan a la interfaz de un dímero y son necesarios para una dimerización estable.
Por intuición, el aumento de la concentración de cloruro incrementaría la formación del complejo. La expresión de equilibrio adecuada para esta reacción es:
Sin embargo, en estas circunstancias, la constante de equilibrio aparente de la dimerización se escribiría por lo general sin especificación explícita del cloruro:
Un poco de álgebra nos lleva a:
Así, si se hubiera medido Kap en disoluciones tampón con distintas concentraciones de
NaCl, cabría esperar que la gráfica de log (Kap) frente a log [Cl] fuera una recta con una pendiente de –2. Este tipo de experimentos pueden ser muy útiles para detectar la participación y la estequiometría de componentes tampón en una reacción.
Obsérvese, sin embargo, que debido a que el ion cloruro y el ion sodio aumentan a la vez que incrementamos la concentración de NaCl, el experimento mostrado anteriormente no indica que sea el cloruro y no el sodio el componente tampón que participa en la reacción. Se podrían realizar experimentos de control para estudiar la dimerización en disoluciones tampón con distintas concentraciones de KCl, KF, NaF,
Na (^) 2SO4, Na (^) 2PO4, etc.; con el fin de comprobar si el importante es el anión o el catión y si la reacción es específica para un anión o catión determinado.
Las proteínas contienen diversos grupos ionizables y es frecuente que participen protones e iones hidrógeno en las reacciones de plegamiento, de cambio conformacional
y de enlace. Así, es habitual que la constante Kap de una reacción varíe en función de la
concentración de [H +^ ]. El pH es igual a –log[H+^ ]; de este modo, la representación
gráfica de Kap frente al pH nos debería mostrar si es necesario uno o más protones para la reacción. No obstante, en algunas ocasiones, puede que un protón enlazado no sea completamente necesario para una reacción, pero que su presencia modifique la constante de equilibrio. Este conjunto de reacciones se podría escribir del siguiente modo:
Supongamos que probamos a enlazar A con B a un pH bajo en el que todas las especies están protonadas y nos encontramos con que [AH+^ ][B]/[AH+^ B] = 10-9^ M. Esto nos da
una estimación de K4. A continuación, repetimos el experimento a un pH elevado en el
