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Informe de la espectrofotometria
Tipo: Ejercicios
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En la actualidad, la preclamsia es uno de los problemas de salud que está generando mayor preocupación a nivel mundial debido a la elevada tasa de morbimortalidad. Una de las causas principales de esta patología es el estrés oxidativo y para identificarlo se realiza una búsqueda de biomarcadores con la de ayuda de la espectrofotometría (1). Esta técnica nos permite cuantificar y analizar la cantidad de luz que absorbe una sustancia. Se utilizará el método de la curva de calibración a partir de varios estándares de para-nitrofenol (pNF) con concentraciones graduales y la lectura de onda de 405 nm, permitiendo comparar la absorbancia frente a la concentración. Además, se empleará el método del factor de calibración, el cual se calcula dividiendo la concentración entre la absorbancia (2). Se elaboró esta práctica de laboratorio con el fin de aprender a cuantificar moléculas específicas mediante la espectrofotometría y utilizar este conocimiento a largo plazo en el desarrollo de nuestra carrera. Para ello se plantearon los siguientes objetivos: explicar los fundamentos de la técnica espectrofotométrica y sus aplicaciones, elaborar la curva de calibración en base a los valores obtenidos y determinar cuantitativamente la concentración de la solución problema. II. MARCO TEÓRICO La espectrofotometría es un método de análisis en el cual es posible identificar la radiación electromagnética absorbida, trasmitida o reflejada por una sustancia. Además, a través la absorbancia nos indica cuánto es la cantidad de luz absorbida. Dicha cantidad absorbida puede ser representada a través de una gráfica a diferentes valores de longitud de onda, denominándose a este, espectro de absorción (3,4). La espectrofotometría se encuentra regida principalmente por la Ley de Larmbert-Beer, la cual sustenta que, a mayor concentración, mayor es la absorbancia. De esta manera, la cantidad de luz que absorbe una sustancia dependerá de su concentración (3,4).
identificar ciertos compuestos dañinos presentes en alguna muestra (característica cualitativa).
3. ¿Cuáles son las funciones de cada una de las partes de un **espectrofotómetro? (4)
5. ¿Qué factores afectan la relación entre la absorbancia y la concentración? Existen factores que afectan la relación entre la absorbancia y la concentración como son (7): - Parte de la energía también será absorbida por el solvente y la pared de la celda que contiene la solución. - La luz incidente quizá no sea totalmente monocromática - La energía puede ser también dispersada III. MÉTODO Se utilizó los siguientes métodos: curva de calibración y factor de calibración, ambos para calcular la concentración de una muestra. III.1 Materiales - Pipetas de vidrio - Cubetas del espectrofotómetro III.2 Equipos - Espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 25 III.3 Reactivos - para-nitrofenol (pNF) - Agua destilada III.4 Procedimiento - Se colocó 3 ml de agua destilada en una cubeta, luego se introdujo la muestra en el espectrofotómetro ajustando la longitud de onda a 405 nm, logrando así calibrar el equipo. - Se preparó 3 muestras en sendas de cubetas de acuerdo con el siguiente esquema: Reactivos Cubetas Nº 1 Nº 2 Nº para-nitrofenol (pNF) (ml) 1 2 3 Agua destilada (ml) 2 1 0
1
f(x) = 0.02 x R² = 1
Concentración (μM) Absorbancia
El espectro de absorción del p-NF muestra que este compuesto presenta 2 picos máximos de absorbancia, el primero a 200 λ (nm) y el segundo a 400 λ (nm) y a partir de este los valores de absorción empiezan a descender hasta mantenerse constante. V.2 Analice la curva de calibración del p-NF. De acuerdo con la gráfica 1 se puede observar que a mayor concentración de p-NF habrá una mayor absorbancia. V.3 ¿Cuál es la longitud de onda de máxima absorción del p-NF? 200 λ (nm) V.4 ¿Observas alguna dependencia entre el valor de absorbancia y la concentración de p-NF en la cubeta? La relación entre la absorbancia y la concentración es directamente proporcional. V.5 Calcula la concentración de p-NF en una muestra si el ensayo ha proporcionado un valor de absorbancia a 405 nm de 0.877. C= A x FC C= 0.877x C= 43. VI. DISCUSIÓN El método empleado fue la Curva de Calibración que consiste en una representación gráfica donde se compara la concentración frente a la absorbancia. Mediante este método se logró identificar que la absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración, ello se debe a que, si hay un mayor número de moléculas habrá mayor interacción de la luz con ellas, debido a que estas pueden absorber dicha energía luminosa (4). Por ende, si el número de moléculas presentes en la sustancia disminuye(concentración), también lo hará la absorbancia. Esto se ve reflejado en los resultados de la tabla 2, en donde la muestra N°3 presenta mayor concentración debida a que no fue diluida con agua
