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Asignatura: Tecnicas instrumentales, Profesor: , Carrera: Farmacia, Universidad: UGR
Tipo: Apuntes
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¡No te pierdas las partes importantes!
Dr. José M. Paredes Martínez Departamento Fisicoquímica Facultad de Farmacia Universidad de Granada
Tema 8: Espectroscopía de Fluorescencia
Bases teóricas
Proceso de emisión de la radiación
Dependiendo del mecanismo de desactivación Bioluminiscencia (en seres vivos)
Quinina Bases teóricas
Barritas luminosas Luminol
Carteles y etiquetas Bioluminiscencia
Bases teóricas M + h (^) 1 M* M
h (^1) h (^2)
λ 1 max^ (excitación) < λ 2 max^ (emisión)
Bases teóricas
Estado singulete fundamental Estado singulete excitado Estado triplete excitado T
S 0 S 1 S 0 S 1 S 0
Bases teóricas
Absorción (^) Absorción
Fosforescencia Relajación vibracional Cruce entre sistemas Conversión interna Conversión externa Procesos de desactivación
Procesos de desactivación
S 0 S 2 S 1 T Absorción (^) Absorción Energía Fluorescencia Fosforescencia Relajación vibracional Cruce entre sistemas Conversión interna Conversión externa Relajación vibracional
Procesos de desactivación
Existe un número relativamente pequeño de moléculas con características estructurales determinadas para emitir fluorescencia. Raramente se observa fluorescencia debido a transiciones *****^ ( (^) ex < 250 nm), en su lugar, la emisión se restringe a los procesos π *****^ π y π *****^ n, que son menos energéticas.
Procesos de desactivación
electrón excitado ( S 1 T 1 ). La probabilidad aumenta si los niveles vibracionales de los dos niveles excitados solapan. La presencia de especies con átomos pesados (como iodo o bromo) u oxígeno en disolución favorece el cruce entre sistemas. S 0 S 2 S 1 T Absorción (^) Absorción Energía Fluorescencia Fosforescencia Relajación vibracional Cruce entre sistemas Conversión interna Conversión externa Procesos de desactivación S 0 S 2 S 1 T Absorción (^) Absorción Energía Fluorescencia Fosforescencia Relajación vibracional Cruce entre sistemas Conversión interna Conversión externa
(singulete o triplete) al fundamental mediante interacción y transferencia de energía entre la molécula excitada y el disolvente u otros solutos ( S 1 S 0 ,T 1 S 0 ), pero sin emisión de radiación.
Tipos de espectros: Espectros de Emisión y Excitación
S 0 S 2 S 1 T Absorción Energía Fluorescencia Relajación vibracional Conversión externa Tipos de espectros: Espectros de Emisión y Excitación
S 0 S 2 S 1 T Absorción Energía Fluorescencia Conversión externa
Tiempos de vida
También se define el tiempo de vida natural como el tiempo de vida si solo se desactivara por fluorescencia f n k 1 f NR f
n Factores que influyen en la intensidad de fluorescencia Estructura química
Factores que influyen en la intensidad de fluorescencia Estructura química HO O O OH O HO O OH O
Factores que influyen en la intensidad de fluorescencia Efecto de la temperatura y del disolvente La intensidad de la fluorescencia disminuye al aumentar la temperatura y al aumentar la viscosidad del disolvente Temperatura : conversión externa, Fluorescencia La fluorescencia también disminuye en presencia de disolventes con átomos pesados Formación triplete : Fluorescencia
Factores que influyen en la intensidad de fluorescencia
Relaciona el efecto de la concentración en la intensidad de fluorescencia I 0 : intensidad de la radiación incidente F k ' (^) f ( I 0 I ) I : intensidad después de atravesar una longitud b del medio bc I I A 0 log bc abc I I 010 I 0 e F k ' (^) f ( I 0 I 0 eabc ) k ' fI 0 ( 1 e^ abc )
......] 2 ( ) ' [ 1 1 2 0 abc F k fI abc Teniendo en cuenta que la absorbancia es: La intensidad de la luz que atraviesa la muestra será: Con lo que la señal de fluorescencia será: La exponencial puede desarrollarse como: bc I I 0 log ; donde: a 2’ Sustituyendo en la primera se obtiene: Factores que influyen en la intensidad de fluorescencia
k Iabc abc F k f I abc f 0 2 0 ......] ' 2 ( ) ' [ 1 1 Siempre que abc < 0.05 los términos superiores del desarrollo se hacen despreciables frente al primero (error relativo en la ecuación del 2.5%). Otros factores de la pérdida de linealidad son:
Desactivación ( Quenching **)
+** Q
Desactivación ( Quenching **)
+** Q h *****
Desactivación ( Quenching )
En el quenching estático se forma un complejo entre el fluoróforo y el quencher en el estado fundamental, y este complejo (que se puede excitar por absorción) o no es fluorescente o tiene distintas propiedades fluorescentes que el fluoróforo no asociado. F F*
F F*^ +Q^ F-Q
+QF F-QF*
F-Q +Q (^) F-Q Se forma un complejo Ejemplo: Una cadena de ADN con un fluoróforo, que cuando hibrida con la cadena complementaria que posee el quencher produce la formación del complejo y disminuye la intensidad de fluorescencia del fluoróforo
Desactivación ( Quenching )
El quencher debe difundir hasta el fluoróforo durante el tiempo de vida del estado excitado, y tras el contacto el fluoróforo éste vuelve al estado fundamental sin emisión de un fotón o con una emisión de características distintas, por lo que se disminuye su intensidad de fluroescencia. F F*
+Q F+Q* h^ ***** Q Q
Desactivación ( Quenching ) El quenching dinámico se describe por la ecuación de Stern-Volmer: Ksv = kq 0 F : intensidad de fluorescencia en presencia del quencher F 0 : intensidad de fluorescencia en ausencia de quencher [Q] : concentración de quencher Ksv : constante de Stern-Volmer kq : constante cinética de quenching (depende de los coeficientes de difusión del fluoróforo y del quencher) 0 : tiempo de vida medio del^ fluoróforo^ (en ausencia de^ quencher)
Ksv Desactivación ( Quenching **)
