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NB: Versión adoptada en la Asamblea Mundial de Delegados de la OIE en mayo de 2010
C A P Í T U L O 2. 1. 1 9
E S T O M A T I T I S V E S I C U L A R
RESUMEN
La estomatitis vesicular ( EV ) es una enfermedad vesicular de los caballos y del ganado bovino y porcino causada por vesiculovirus de la familia Rhabdoviridae. Cuando no afecta a los caballos, no se puede diferenciar clínicamente de la fiebre aftosa o glosopeda ( FA ) , del exantema vesicular porcino ( EVP ) ni de la enfermedad vesicular de los cerdos ( EVC ). Las ovejas, cabras y muchas otras especies salvajes pueden resultar infectadas. El hombre también es susceptible. La enfermedad se circunscribe a las Américas; sin embargo, se ha descrito previamente en Francia y en Sudáfrica.
Este virus se transmite directamente por vía transcutánea o transmucosa y se ha aislado de flebótomos y de mosquitos. Se ha comprobado la transmisión experimental de la mosca negra tanto a cerdos como a ganado bovino. Existe una variación estacional en los casos de EV: desaparece al final de la estación lluviosa en las áreas tropicales y, con las primeras heladas, en las zonas templadas. También hay pruebas de que podría ser un virus vegetal y que los animales son el final de la cadena epidemiológica. La patogenia de la enfermedad está poco clara, y se ha observado que los anticuerpos humorales específicos no siempre evitan la infección por virus del serogrupo de la EV.
Aunque se puede sospechar que se trata de la EV cuando hay caballos afectados, además de cerdos y vacas, es esencial un diagnóstico diferencial precoz porque los signos clínicos de la EV son imposibles de diferenciar de los de la FA cuando afecta al ganado bovino y al porcino, y de los de la EVC o la EVP cuando solo afecta a los cerdos.
Identificación del agente: El virus se puede aislar fácilmente por inoculación de varios sistemas de cultivo de tejidos, ratones lactantes o huevos embrionados de pollo. Se puede detectar ARN del virus en el tejido epitelial y en el líquido vesicular mediante la reacción en cadena de la polimerasa ( PCR ) con transcripción inversa convencional y en tiempo real. El antígeno vírico se puede identificar mediante un enzimoinmunoensayo indirecto en sándwich ( IS-ELISA ) – esta es la prueba más rápida y barata. La prueba de fijación del complemento ( FC ) es también una buena alternativa. Puede utilizarse la prueba de neutralización del virus ( NV ) , pero es elaborada y lleva tiempo.
Pruebas serológicas: Los animales convalecientes desarrollan anticuerpos específicos de serotipo a los 4–8 días de la infección que se ponen de manifiesto mediante un ELISA de bloqueo en fase líquida ( LP-ELISA ), mediante un ELISA de competición ( C-ELISA ) y mediante la NV. Otras pruebas que se han descrito son la FC, la inmunodifusión en gel de agar y la contra- inmunoelectroforesis.
Requisitos para las vacunas: En EE.UU. y en Colombia se han usado vacunas con virus inactivados y con hidróxido de aluminio o aceite como adyuvantes, respectivamente. Ambas vacunas inducen unos niveles altos de anticuerpos específicos en los sueros del ganado bovino vacunado. Sin embargo, no está todavía claro que los anticuerpos séricos eviten la enfermedad. Se ha utilizado en condiciones de campo una vacuna con virus atenuados de eficacia desconocida.
A. INTRODUCCIÓN
La estomatitis vesicular (EV) fue descrita en Estado Unidos (EE.UU.) por Oltsky et al. (1926) y Cotton (1927) como una enfermedad vesicular de los caballos, y posteriormente del ganado bovino y de los cerdos. Las vesículas las causa el virus de la EV en la lengua, los labios, la mucosa bucal, los pezones, y en el epitelio de la banda coronaria del ganado bovino, los caballos, los cerdos, y muchas otras especies de animales domésticos y
salvajes. La enfermedad natural es muy infrecuente en las ovejas y las cabras, aunque ambas especies se pueden infectar experimentalmente. En los mismos rebaños de ganado bovino, se han presentado casos de infecciones mixtas por el virus de la fiebre aftosa (FA) y de la estomatitis vesicular (EV) y dichas infecciones se pueden inducir de modo experimental. También son susceptibles muchas especies de animales de laboratorio. La enfermedad se circunscribe a las Américas; no obstante, se describió en Francia (en 1915 y 1917) y en Sudáfrica (en 1886 y 1897) (Hanson, 1952).
En los humanos que están en contacto con animales afectados por EV o que manejan el virus infeccioso, se han observado signos semejantes a los de la gripe, normalmente sin vesículas. Todas las manipulaciones relacionadas con el virus, incluyendo el material infeccioso de los animales, deben llevarse a cabo con las medidas de bioprotección adecuadas.
Hay dos clases inmunológicas bien diferenciadas del virus de la estomatitis vesicular (VSV) reconocidas hasta la fecha, el de New Jersey (NJ) y el de Indiana (IND). Ambos virus pertenecen al género Vesiculovirus , de la familia Rhabdoviridae, y se han estudiado con detalle a nivel molecular. En las últimas décadas se han aislado de animales enfermos otros rhabdovirus estrechamente relacionados. Existen tres subgrupos del serotipo IND, según las relaciones serológicas: IND-1, IND-2 e IND-3; también se conocen como virus IND clásico (VSIV), virus cocal (COCV) y virus alagoas (VSAV), respectivamente (Federer et al ., 1967). Las cepas del serotipo NJ y del subtipo IND-1 son endémicas en el ganado de zonas del sur de México, Centroamérica, Venezuela, Colombia, Ecuador y Perú, donde el VSV NJ es la causa de la gran mayoría de los casos clínicos (>80%). Se ha descrito una actividad esporádica del VSV serotipo NJ y del VSV subtipo IND-1 en el norte de México y en el oeste de EE.UU. El IND-2 se ha aislado únicamente en Argentina y Brasil y tan solo en caballos (Salto-Argentina/63, Maipú-Argentina/86, Rancharia-Brasil/66, Riberao-Brasil/79) (Alonso et al ., 1991; Alonso Fernandez & Sondahl, 1985). El ganado que vivía junto a los caballos afectados no desarrolló anticuerpos contra el VSV (Alonso et al ., 1991). El subtipo IND-3 (Alagoas-Brasil/64) se ha identificado esporádicamente solo en Brasil y únicamente en caballos hasta 1977. Sin embargo, en 1977 se aisló por primera vez el serotipo IND-3 (cepa Espinosa-Brasil/77) en ganado bovino en Brasil; se ha observado que este serotipo afecta al ganado bovino en menor grado que a los caballos (Alonso et al ., 1991; Alonso Fernández & Sondahl, 1985). Este hallazgo confirma las primeras descripciones, de 1926 y de 1927 (Cotton, 1927; Oltsky et al ., 1926) de los serotipos NJ e IND en caballos, y posteriormente en ganado bovino y en cerdos; esta misma predilección se ha observado en otros brotes de la EV.
El mecanismo de transmisión del virus no está claro. Los virus se han aislado de flebótomos, mosquitos y otros insectos (Comer et al ., 1992; Francy et al ., 1988; Mason, 1978). Se ha observado que se produce transmisión experimental del serotipo NJ de la EV de la mosca negra ( Simulium vittatum ) a cerdos y a ganado bovino (Mead et al ., 2004; 2009). También hay hipótesis que sostienen que el virus de la EV es un virus vegetal presente en el pasto (Mason, 1978) y que los animales están al final de la cadena epidemiológica. En circunstancias especiales, el virus podría sufrir un proceso de adaptación para infectar a los animales, seguido de una transmisión directa entre animales susceptibles. Durante la epizootia de 1982 del oeste de EE.UU., hubo muchos casos de transmisión directa de animal a animal (Sellers & Maarouf, 1990). Aunque no todos los años se diagnostica la EV en el ganado de EE.UU., se considera que es endémica entre los cerdos salvajes en Ossabaw Island, Georgia (Boring & Smith, 1962).
La incidencia de la enfermedad varía mucho entre los rebaños afectados. Normalmente, el 10-15% de los animales presenta signos clínicos. Se observan casos clínicos principalmente en animales adultos. Los bóvidos y los caballos de menos de 1 año de edad casi nunca resultan afectados. La mortalidad en ambas especies está cercana a cero. Sin embargo, se ha observado una elevada mortalidad en los cerdos afectados por el virus NJ. Los animales enfermos se recuperan aproximadamente a las 2 semanas. Las complicaciones de importancia económica más corrientes son la mastitis y la pérdida de producción en los rebaños lecheros (Lauerman et al ., 1962). En los brotes de 1995, 1997 y 1998 de EE.UU., tanto el serotipo NJ como el IND-1 causaron fundamentalmente signos clínicos en los caballos. Aunque se observaron algunos signos clínicos en los bóvidos, el principal hallazgo en esta especie fue la seroconversión.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
La EV no se puede diferenciar clínicamente con certeza de otras enfermedades vesiculares, como la fiebre aftosa o glosopeda (FA), el exantema vesicular porcino (EVP) ni la enfermedad vesicular de los cerdos (EVC) cuando no hay caballos implicados. En cualquier caso sospechoso de EV, es urgente un diagnóstico de laboratorio en las primeras fases de la enfermedad.
La toma de muestras y la tecnología utilizada para el diagnóstico de la EV deben estar en concordancia con la metodología utilizada para el diagnóstico de la FA, el EVP y la EVC, a fin de facilitar el diagnóstico diferencial de estas enfermedades vesiculares. Nota: los virus del serogrupo de la EV pueden ser patógenos para los humanos y se deben tomar precauciones adecuadas cuando se trabaja con tejidos potencialmente infectados con virus
la fijación del complemento (FC) o mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se pueden realizar pruebas similares en suspensiones homogeneizadas de tejidos del músculo esquelético diseccionado de ratones muertos y de embriones de pollo y con suspensiones de muestras epiteliales. El tejido cerebral de los ratones es una fuente excelente de virus.
Debido a las diferentes características morfológicas de los rhabdovirus (virus del serogrupo de la EV), picornavirus (virus de la FA y de la VEC) y calicivirus (VEP), y al gran número de partículas víricas presente en los líquidos vesiculares y en los tejidos epiteliales, la microscopía electrónica puede ser un instrumento de diagnóstico útil para averiguar cuál es la familia de virus implicada.
Los métodos inmunológicos de elección para identificar los antígenos víricos en el laboratorio son ELISA (Alonso et al ., 1991; Ferris & Donaldson, 1988), la prueba de la FC (Alonso et al ., 1991; Jenny et al ., 1958) y la tinción inmunofluorescente. La prueba de neutralización del virus (NV), con antisueros que se sepa que son positivos, contra los serotipos NJ e IND del virus de la EV se puede utilizar en cultivos de tejidos, ratones lactantes o huevos embrionados, pero lleva más tiempo.
a) Aislamiento del virus
i) Se inocula el cultivo celular en tubos Leighton y en frascos de 25 cm 2 con la suspensión de tejidos clarificada o con el líquido de las vesículas.
ii) Se incuban los cultivos celulares inoculados a 37°C durante 1 hora.
iii) Se retira el inóculo y se lavan los cultivos celulares tres veces con medio de cultivo y se sustituye por medio de cultivo que contenga un 2,5% se suero fetal bovino (FBS).
iv) Se incuban los cultivos celulares en tubos Leighton a 33–35°C y se observa el ECP.
v) Después de 18–24 horas de incubación, el cubre de un cultivo en tubo Leighton por cada muestra inoculada se tiñe con anticuerpo conjugado a una sustancia fluorescente (AF) específico de las cepas New Jersey e Indiana del virus de la EV.
vi) El resto de los cultivos en tubos Leighton y de los cultivos en frascos de 25 cm 2 se incuban a 35–37°C otros 6 días y se observa diariamente si presentan EPC.
vii) A los 7 días post-inoculación, el resto de los cubres de los tubos Leighton se tiñen con AF.
viii) Si se observa ECP y la tinción con AF es negativa, se realiza un segundo pase, como se indicó anteriormente, usando las células de un frasco de 25 cm 2. Nota: Los cultivos primarios con un efecto citopático elevado pueden dar resultados falsos negativos en una prueba de inmunofluorescencia. Se pueden preparar diluciones decimales seriadas para inocularlas y obtener placas de células fluorescentes bien diferenciadas.
ix) Interpretación de los resultados: Si no se observa fluorescencia ni efecto citopático en el cultivo, la muestra es negativa en cuanto al aislamiento de virus. La observación de fluorescencia específica indicará que en la muestra se ha aislado el virus.
x) Alternativamente los cultivos celulares de frasco se pueden inocular con muestras de campo, incubarse a 35–37°C durante 48 horas y observarse diariamente para averiguar si presentan efecto citopático. Si tras 48 horas no se observa el efecto citopático, los cultivos de frasco se congelan y descongelan y el sobrenadante se inocula en cultivo celular fresco. Se realizan hasta tres pases, cada uno de 48 horas. Para detectar la presencia del antígeno del VSV, los sobrenadantes clarificados de cada pase se someten a pruebas de ELISA y de FC.
b) Enzimoinmunoensayo
El ELISA indirecto en sándwich (IS-ELISA) (Alonso et al ., 1991; Ferris & Donaldson, 1988) actualmente es el método de diagnóstico para identificar serotipos víricos de la EV y de otras enfermedades vesiculares. Específicamente, el procedimiento ELISA identifica todas las cepas del virus de la EV del serotipo IND, con un conjunto de antisueros polivalentes obtenidos en conejo/cobaya preparados contra los viriones de las cepas representativas de los tres subtipos del serotipo IND (Alonso et al ., 1991). Para la detección de las cepas New Jersey del virus de la EV, es adecuado un conjunto de antisueros monovalentes obtenidos en conejo o cobaya (Alonso et al ., 1991; Ferris & Donaldson, 1988).
- Procedimiento de la prueba
i) Fase sólida: Las placas de ELISA se recubren durante 1 hora a 37ºC o durante toda la noche a 4ºC con antisuero de conejo y suero normal de conejo (como han descrito Alonso et al ., 1991 y Allende et al ., 1992), y lo óptimo es diluirlos en tampón de carbonato/bicarbonato, a pH 9,6. Después, las placas
se lavan una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se bloquean durante 1 hora a temperatura ambiente con un 1% de ovoalbúmina en PBS. Las placas se utilizan de inmediato o se lavan tres veces y se guardan a –20°C para uso futuro.
ii) Muestras de ensayo: Se depositan en los correspondientes pocillos las suspensiones de antígeno de las muestras a analizar (suspensiones al 10–20% de tejido epitelial, tejido muscular esquelético de embrión de pollo o de ratones en PBS, o sobrenadantes clarificados de cultivos celulares sin diluir) y se incuban las placas 1 hora a 37°C en un agitador orbital.
iii) Detector: A los pocillos correspondientes se añaden antisueros monovalentes o polivalentes obtenidos en cobaya contra los serotipos NJ e IND, respectivamente, del virus de la EV, que sean homólogos al suero de conejo de recubrimiento y que se han diluido convenientemente en PBS con un 0,05% de Tween 20, un 1% de ovoalbúmina, un 2% de suero normal de conejo y un 2% de suero bovino normal (PBSTB). Se deja reaccionar durante 30-60 minutos a 37°C en un agitador orbital.
iv) Conjugado: Se añade un conjugado de peroxidasa/IgG obtenida en conejo o cabra anti-Ig de cobaya, diluido en PBSTB, y se deja reaccionar durante 30-60 minutos a 37°C en un agitador orbital.
v) Sustrato: Se añade como sustrato H 2 O 2 y se deja reaccionar a temperatura ambiente durante 15 minutos, añadiendo después ácido sulfúrico para detener la reacción. Los valores de absorbancia se miden en un lector de ELISA.
A lo largo de la prueba, se utilizan volúmenes de reactivo de 50 μl. Las placas se lavan cinco veces en cada paso con PBS que contenga un 0,05% de Tween 20. Se incluyen controles de los reactivos utilizados.
vi) Interpretación de los resultados: Un antisuero que dé una absorbancia un 20% superior a la de otro antisuero, del suero negativo y de los controles, se considera positivo para el correspondiente subtipo vírico.
c) Prueba de la fijación de complemento
El método ELISA es preferible a la prueba de FC, porque es más sensible y no está afectado por factores pro- ni anti-complemento. Sin embargo, cuando no se dispone de reactivos para el ELISA, se puede realizar la prueba de FC. Se describe la prueba de FC para placas de microtitulación con pocillos de fondo en forma de U, utilizando los reactivos titulados mediante la prueba de la CF50%.
- Procedimiento de la prueba
i) Antisueros: En los pocillos de la placa se deposita el antisuero monovalente anti-subtipo NJ y el antisuero polivalente anti-subtipo IND, ambos obtenidos en cobaya, contra el virus de la EV, diluidos en tampón veronal (VB) a una dilución que contenga 2,5 CFU 50 (unidades de 50% de fijación de complemento), contra el virus homólogo. Estos antisueros son los detectores utilizados en la prueba ELISA.
ii) Muestras a analizar: Se añaden a los pocillos con suero las suspensiones de antígeno de las muestras a analizar, preparadas como se describe para la prueba IS-ELISA.
iii) Complemento: Se añaden al suero y al antígeno 4 CHU 50 (unidades de complemento que causan un 50% de hemólisis). (Una alternativa es utilizar 7,5, 10 y 20 CHU 50 con objeto de alcanzar 4 CHU 50 en la prueba). La mezcla de antisueros, muestras a analizar y complemento se incuba a 37°C durante 30 minutos.
iv) Sistema hemolítico: Se añade a los pocillos una suspensión de eritrocitos de oveja (RBC) en VB, sensibilizados con 10 HU 50 (unidades hemolíticas que causan un 50% de hemólisis) de suero de conejo anti-eritrocitos de oveja (anti-SRBC). El sistema hemolítico tiene un valor de absorbancia de 0,66 a 545 nm, en la proporción de dos volúmenes de sistema hemolítico más tres volúmenes de agua destilada. La mezcla se incuba durante 30 minutos a 37°C. A continuación, las placas se centrifugan y la reacción se observa visualmente.
Se necesitan volúmenes de 25 μl para los antisueros, muestras a analizar y complemento, y 50 μl de sistema hemolítico. Se incluyen los controles apropiados de los antisueros, antígenos, complemento, y sistema hemolítico.
Es posible llevar a cabo la prueba de CF50% en tubos (Alonso et al ., 1991) utilizando volúmenes de reactivo ocho veces superiores a los indicados para la FC en placas de microtitulación. Con la prueba FC50%, la reacción se puede expresar como lectura espectrofotométrica de la absorbancia a 545 nm.
v) Interpretación de los resultados: Cuando los controles son los esperados, las muestras con una hemólisis de un antisuero un 20% inferior a la del otro y a la de los controles, se consideran positivas para el tipo correspondiente.
y se añade a cada pocillo 50 μl de solución de tetrametil-benzidina (TMB) como sustrato. Se incuban las placas a 25°C durante 5–10 minutos y después se añaden a cada pocillo 50 μl de ácido sulfúrico 0,05 M. Se leen las placas a 450 nm, y la densidad óptica de los pocillos del diluyente control debe ser
1,0.
iv) Interpretación de los resultados: Una muestra es positiva si la absorbancia es 50% de la absorbancia del diluyente control. Es importante tener en cuenta que se han observado caballos infectados de forma natural con la cepa New Jersey del virus que han dado positivo en esta prueba al menos durante 5 años tras la infección.
b) Neutralización del virus (prueba prescrita para el comercio internacional)
La prueba de la NV se lleva a cabo en placas de microtitulación de cultivo celular con pocillos de fondo plano utilizando suero inactivado como muestra problema, 1.000 DICT 50 (dosis infectiva del 50% en cultivo tisular) de las cepas NJ o IND del virus de la EV, y células vero M, o monocapa preformada (Allende et al .,
- o una suspensión de células IB-RS-2 para determinar si hay virus no neutralizado.
- Procedimiento de la prueba
i) Virus: Se cultiva virus de la EV de las cepas NJ o IND en monocapas de células Vero y se guarda en nitrógeno líquido o se congela a –70ºC.
ii) Muestras a analizar: Se inactivan los sueros a 56°C durante 30 minutos antes de la prueba. En la prueba se incluyen sueros estandarizados como control positivo y negativo.
iii) Neutralización del virus: Se diluyen los sueros en las placas en series de diluciones a la mitad o a la cuarta parte, comenzando con una dilución a 1/4. Se utilizan dos filas de pocillos por suero. Se añade el mismo volumen de la suspensión de virus de la EV de las cepas NJ o IND que contenga aproximadamente 1.000 DICT 50 /25 μl y se incuba a 37°C durante 60 minutos para permitir que tenga lugar la neutralización. A continuación, se depositan 50 μl de las mezclas en las monocapas celulares preformadas en placas de microtitulación o se añaden 150 μl de suspensiones celulares de IB-RS-2 o Vero con 300.000 células/ml a cada pocillo con las mezclas suero/virus. Se cubren las placas con tapas no herméticas y se incuban 48–72 horas a 37°C en una atmósfera con un 5% de CO 2 o bien se sellan con cinta sensible a la presión y se incuban en atmósfera normal. (Se ha determinado que un título de virus de 1.000 DICT 50 disminuye las reacciones inespecíficas y mantiene una elevada sensibilidad de la prueba).
iv) Interpretación de los resultados: Los pocillos sin ECP se consideran positivos. Los títulos a punto final de los títulos de los sueros analizados se determinan por el método de Spearman–Kärber cuando los títulos víricos están entre 750 y 1.330 DICT 50 y cuando los títulos de los sueros estándar positivos y negativos están dentro del doble de sus valores medios estimados en una titulación previa. Los títulos de cada suero para una neutralización del 100% se expresan como log 10. Los sueros con valores de 1/32 o superiores se consideran positivos para los anticuerpos contra el VSV. Es importante tener en cuenta que se han observado caballos infectados de forma natural con la cepa New Jersey del virus que han dado positivo en esta prueba al menos durante 5 años tras la infección. En un protocolo alternativo, se determina el título final del suero analizado cuando la dosis de virus es de 10 2±0,5/100 μl y cuando los títulos de los sueros estándar positivos y negativos están dentro del doble de sus valores medios estimados en una titulación previa. El título de cada suero para un 50% de neutralización se expresa como log 10. Los sueros con valores de 1,3 (1/20) o superiores se consideran positivos para anticuerpos de la EV (Allende et al ., 1992).
c) Fijación de complemento (una prueba prescrita para el mercado internacional)
En el apartado B.1.b. se ofrece una descripción detallada de esta prueba. Se modifica del siguiente modo. La prueba de FC se puede utilizar para la cuantificación de anticuerpos tempranos, principalmente IgM. Con este fin, se mezclan diluciones del suero a la mitad con 2 CFU 50 de antígeno conocido y con un 5% de suero bovino normal o de ternero incluido en 4 CHU 50 de complemento. La mezcla se incuba durante 3 horas a 37°C o durante toda la noche a 4°C. A continuación, se añade el sistema hemolítico y se incuba durante 30 minutos a 37°C. El título del suero es la dilución más alta a la que no se observa hemólisis. Los títulos de 1/5 o superiores se consideran positivos. Esta prueba de la FC tiene una sensibilidad baja y frecuentemente se ve afectada por factores anticomplementarios o inespecíficos.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS
1. Antecedentes
a) Fundamentos y uso previsto del producto
Las infecciones por el virus de la estomatitis vesicular pueden influir de manera importante en la salud y en la producción de los animales, dando lugar a considerables pérdidas económicas para los productores. La reducción de la ingesta de alimento derivada de las lesiones orales puede dar lugar a una pérdida de peso y a retrasos en el peso de venta. Las lesiones de las patas pueden causar problemas locomotores temporales que afecten a la capacidad de un animal de conseguir alimento y agua, y los problemas de patas crónicos pueden provocar el desvieje del animal. Las lesiones en la glándula mamaria pueden influir en la capacidad de la madre de alimentar a las crías y a la producción de leche destinada al consumo humano. Las lesiones graves en la glándula mamaria o los pezones pueden provocar el desvieje del animal. Cuando se aplica la vacunación, las vacunas se utilizan para reducir la gravedad de los signos clínicos y del impacto económico que ejerce la enfermedad.
En EE.UU., Panamá, Guatemala, Perú y Venezuela se han probado vacunas con virus atenuados en el campo (Lauerman et al ., 1962; Mason, 1978), pero no se conoce su eficacia. En Colombia y Venezuela se producen vacunas muertas de los serotipos Indiana y New Jersey (revisión vacunal de la OIE de 2002).
En el capítulo 1.1.8. Principios para la producción de vacunas veterinarias, se presentan las directrices para la producción de vacunas veterinarias. Las normas dadas aquí y en el capítulo 1.1.8 tienen carácter general y pueden complementarse con requisitos nacionales o regionales.
2. Resumen de la producción y requisitos mínimos para las vacunas convencionales
a) Características del inóculo
i) Características biológicas
Deben estar bien documentados la identidad del inóculo y el origen del suero utilizado en el crecimiento y en los pases de los virus, incluidos la fuente y el historial de pases del microorganismo.
ii) Criterios de calidad (esterilidad, pureza, ausencia de agentes externos)
Se debe demostrar la pureza del inóculo y de las células que se utilizan para la producción de la vacuna. El inóculo original (MSV) debe estar libre de agentes indeseables, bacterias o Mycoplasma , lo cual se debe garantizar realizando pruebas que sean sensibles para detectar estos microorganismos. La muestra a analizar debe contener un título suficiente para la producción de la vacuna, pero no un título tan alto como para que el suero hiperinmune sea incapaz de neutralizar el virus de siembra durante el análisis de la pureza. El virus del inóculo se neutraliza con un antisuero monoespecífico o con un anticuerpo monoclonal contra el virus del inóculo, y la mezcla virus/anticuerpo se cultiva sobre monocapas de varios tipos de líneas celulares. Se recomienda una línea celular muy permisiva para el virus de la diarrea vírica bovina, de los tipos 1 y 2, como una de las líneas celulares elegidas para la evaluación del MSV. El virus de la diarrea vírica bovina es un contaminante potencial introducido por el uso de suero fetal bovino en los sistemas de cultivos celulares. Los cultivos se someten a pases cada 7 días durante al menos 14 días y después se analizan para comprobar si contienen virus indeseables que puedan haber infectado las células o el inóculo durante los pases previos.
b) Método de producción
i) Procedimiento
Una vez se ha visto que la vacuna es eficaz, y que las condiciones de producción propuestas son aceptadas por las autoridades competentes, se puede obtener la aprobación para producir la vacuna. El virus del inóculo puede multiplicarse en cultivos celulares. La selección del tipo celular para el cultivo depende del grado de adaptación del virus, del crecimiento en el medio, y del rendimiento vírico en el sistema de cultivo específico. Los productos de la vacuna deben limitarse al número de pases del MSV que se demuestre que es eficaz. En general, se trabaja con monocapas o con sistemas celulares en suspensión a gran escala en condiciones estrictas de temperatura controlada, condiciones asépticas y métodos definidos de producción, para asegurar la igualdad entre lotes. La dosis de virus utilizada para inocular el cultivo celular debe mantenerse al mínimo para reducir la posibilidad de que interfieran partículas víricas defectuosas. Cuando el virus ha alcanzado su título adecuado, determinado por su ECP, por inmunofluorescencia o por otra prueba aprobada, dicho virus se clarifica, se filtra y se inactiva (en el caso de las vacunas muertas).
ii) Requisitos para los sustratos y los medios
Debe demostrarse que los cultivos celulares están libres de virus extraños. Todos los productos de origen animal utilizados en la producción y mantenimiento de las células (es decir, tripsina, suero fetal bovino) y en el cultivo de los virus deben estar libres de agentes extraños, y debe prestarse especial atención a la presencia de virus de la diarrea vírica bovina.
iii) Controles durante el proceso
ii) Requisitos de eficacia
Para la producción animal
El/los virus utilizados en la producción de vacunas deben estar antigénicamente relacionados con los virus que se encuentran en el campo. Se debe utilizar un estudio de vacunación/desafío en la especie para la que va a ser utilizada, a fin de indicar el grado de protección que proporciona la vacuna. Las especies utilizadas en los estudios de vacunación/desafío deben carecer de anticuerpos contra la estomatitis vesicular. Los estudios de vacunación/desafío deben llevarse a cabo utilizando virus producidos mediante el método de producción previsto, al máximo número de pases de virus permitido y utilizando un modelo animal experimental. Es necesario confirmar la sensibilidad, la especificidad, la reproducibilidad y la significación estadística y el nivel de confianza de este modelo experimental.
Los niveles de anticuerpos tras la vacunación medidos in vitro podrían utilizarse para evaluar la eficacia de la vacuna, siempre que se haya llevado a cabo un estudio de la correlación en el que se haya obtenido significación estadística. En el caso de las vacunas que contengan más de un virus (por ejemplo, New Jersey e Indiana-1), la eficacia de los diferentes componentes de estas vacunas debe establecerse en cada caso por separado y luego conjuntamente para comprobar si existe interferencia entre los diferentes virus.
Antes de que un producto sea aprobado, debe determinarse la duración de la inmunidad de la vacuna y la frecuencia de vacunación recomendada. En principio, dicha información se adquiere directamente mediante los estudios de vacunación/desafío en el animal hospedador. El período de protección demostrada, medida según la capacidad de los vacunados de resistir una exposición mediante una prueba válida, se puede incorporar en las indicaciones incluidas en el prospecto de la vacuna.
Si la vacuna se utiliza en caballos, cerdos, ganado bovino u otros rumiantes destinados al comercio y al consumo humano, debe establecerse un período de retirada que dependerá del adyuvante utilizado (generalmente será de 21 días), mediante un examen histopatológico cuyos resultados se enviarán a las autoridades sanitarias responsables de la inocuidad alimentaria.
Para el control
Se aplican los mismos principios que para la utilización en producción animal. Además, es importante observar que las respuestas de anticuerpos en animales vacunados pueden no ser diferenciables de las de los animales expuestos al virus natural. Por tanto, para determinar la exposición al virus natural, los animales vacunados tendrán que identificarse claramente si, además de los signos clínicos compatibles con la enfermedad, van a utilizarse métodos serológicos.
iii) Estabilidad
Las vacunas deben guardarse a 4-8°C, con la mínima exposición posible a la luz. El periodo de validez debe determinarse a lo largo del período de viabilidad propuesto utilizando la prueba de potencia aprobada (apartado C.5.b).
3. Vacunas desarrolladas mediante biotecnología
a) Vacunas existentes y sus ventajas
Ninguna
b) Requisitos especiales para las vacunas desarrolladas mediante biotecnología, si las hay
Ninguno
BIBLIOGRAFÍA
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