¡Descarga Experimentos Cromatograficos y más Apuntes en PDF de Bioquímica solo en Docsity!
Kromatografia
Kromatografiaren bereizketa mekanismoak
Biomolekulen banaketa euren desberdintasun fisikoetan oinarritzen da: Polaritatea / karga netoa / tamaina… Hala ere polaritatea garrantzitsuena da. Polaritatea: Molekulen berezko ezaugarria molekulen arteko loturen araberakoa: Atomoek elektronegatibitate desberdina dute, ondrioz dentsitate elektronikoa loturaren alde batean geratzen da, polaritatea ezarriz ( positiboki kargatuta geratzen da alde bat eta bestea negatiboki kargatuta Polaritateak molekulen hainbat ezaugarri baldintzatzen ditu: Solubilitatea / adsortzioa / lurrunkortasuna: Polar-Polar lotura oso sendoa da, ondorioz likido egoeran egon daitezke (ura) Apolar-Apolar lotura ahula da, ondorioz gas egoeran egoten da (metanoa) Bakoitza antzerakoarekin elkartzen da. Kromatografian oinarrizkoak: Polaritatea IGO Solubilitatea IGO / Polaritatea IGO Lurrunkortasuna IGO / Polaritatea IGOAdsortzioa IGO Adsortzioa: Molekula batek geruza batekin duen itsaskortasuna. Karga: Zenbait biomolekulek, hala nola; Aminoazidoek talde azido edo basikoak dituzte, hauek ingurunearen pHaren arabera karga positiboa edo negatiboa izanik: Aminoazidoak: Katioi forma (NH3+) / Zwitterioi forma (NH3+^ eta COO-) / Anioi forma (COO-) Tamaina: Tamaina handiagoko molekulak/biomolekulak arinago eluitzen dira tamaina txikiagokoak baino. Proteinetan Egitura eta funtzioa erabat lotuta daude: Antzeko egitura duten proteinek antzerako funtzioa dute.
Kromatografia sistemen osagaiak
Fase Geldikorra solidoa, gel aedo solido-likido nahasketa bat izan daiteke, baita ere kromatografia-ohantze deitzen zaio. Fase geldikorra desberdina izan daitekeenez molekula desberdinak banatzeko erabiltzen da mota bakoitza, ondorioz kromatografia mota desberdin ugari egonik. Formato desberdinak egon daitezke; 1.- Kromatografia zutabea; zutabea zenbat eta estuagoa eta luzeagoa izan, orduan eta eraginkorki banatzen dira molekulak kromatografia egitean. 2.- Geruza lauan egindako kromatografia (Thin Layer Chromatography); Kapilaritate bidez egindako kromatografia, Paper Kromatografiaren (Tinta baten osagaiak diren koloreak banandu etanolarekiko edo beste substantzia batekiko kapilaritate bidez) antzekoa. Normalean erretxina bat; polímero bat izaten da industrialki sortutakoa (Sephadex edota Sephacryl)
Fase Mugikorra Lagina bultzarazten duen fasea, likidoa edo gasa (Gas kromatografia, hidrokarburoak aztertzeko) Kromatografiaren emaitzean eragina daukate Laginak / Fase Geldikorrak / Fase Mugikorrak Indar Atzeratzaileak (Fase Geldikorra) Indar Bultzatzaileak (Fase Mugikorra) Irudian ikus daitekeen bezala, Fase Mugikorrak Indar Bultzatzailea eragiten du Proteinak zutabean zehar eta Fase Geldikorrean zehar mugitzeko, berriz Fase Geldikorrak Kontrako noranzkoa duen Indar Atzeratzailea egiten du, hauek desberdinak dira banandu nahi diren molekula edo proteinen arabera, Indar Bultzatzaileak handiagoak izanik Fase Mugikorraren antzekoa denean eta Indar atzeratzaileak handiagoak izanik Fase Geldikorraren antzekoa denean kontrako indarra ahulagoa izanik. Haien osaera kontuan izanik arinago edo beranduago eluituz. Kromatografia batik bat Proteinak purifikatzeko erabiltzen da, hauek lagin batetik frakzionatuz/isolatuz.
balioan tontorrak duen zabalera zenbat eta txikiagoa izan orduan eta zehatzagoa izango da kromatografia, molekulak banantzeko behar den eluzio-denbora txikiagoa baita. Kromatograman ikus daitekeen bezala, hasieran seinale-intentsitate balioa txikia da eta handitzen doa, hasieran bananadu nahi diren molekulak beste partikula batzuekin ateratzen direlako, baina denbora igaro ahal gero eta puruago ateratzen dira ezaugarri zehatzetako osagaiak. Tontorraren puntak esan nahi du molekula kontzentrazioa handiena dela. Oharra: Tontorren tamainak ez du esan nahi eluitutako molekula bat ugariagoa dela, adierazten dena da Seinale-Intentsitate handiagoa duela, hau da, Argi Ultramore gehiago absorbatzen duela. Analisi kuantitatiboa: Eluitutako molekula baten kontzentrazioa eta ugaritasuna kalkulatzeko molekula horren Erreferentzia zehatz (Kontzentrazio ezagun bat izanik eta haren pisu zehatza lortzeko bolumen ezaguna gehituz) bat erabili beharko litzateke, ondoren biak konparatuz (Gaur egun ordenagailu bidez eginda, tontorren azalerak konparatuz) Analisi kualitatiboa: Gainera ondorioztatzeko zein substantzia den eluitu dena, Erreferentzia puru bat erabiliz eluitutako molekula zein den ikus daiteke, eluzio- denbora berdina eta antzerako tontorra emanik. Kromatografiaren funtsa, banaketa edo partiketa koefizientea (KD) da. Honek, analito jakin baten banaketa deskribatzen du nahastezinak diren bi faseren artean. Formula hau jarraituz kalkula daiteke: Kontzentrazioa g fasean = KD Kontzentrazioa m fasean g Fase geldikorra izanik eta m Fase mugikorra. Tenperatura zehatz batean erabiltzen da definizio hau.
tA L A Disoluzio akuoso batera konposatua gehitu, eta ondoren disolbatzaile organikoa gehitzen da. Eragin ondoren konposatua partzialki 2 disolbatzaileetan banatuko da. Oreka lortzean, disolbatzaile bakoitzeko solutu kontzentrazioak CO (Disolbatzaile organikoan) CA (Disoluzio urtsuan) edo disolbagarritasunak SO eta SA. KD (Banaketa-koefizientea) ez da solutu- kantitatearen menpekoa; zenbaki konstante bat da. Adb: 15 gradu zentrigadotan solutuaren disolbagarritasuna 100mL eterretan 12g-koa da, eta 100mL uretan, 6g/100mL-koa. Beraz Solutua eterrean eta uretan banatzean, disolbatzaile organikoko kontzentrazioa disoluzio akuosokoa baino 2 aldiz handiagoa izango da, KD=2 delako. Solutuaren disolbagarritasuna fase organikoan =(KD)A Solutuaren disolbagarritasuna disoluzio urtsuan tR=tM+tA tM= Eduki-denbora edo denbora hila (Hold-up volume edo dead time/volume) Fase mugikorrak zutabea zeharkatzeko behar duen denbora. Neurtzeko lehenengo eluitu den osagaia erabiltzen da, osagai honek fasae geldikorrarekin elkarrekintzarik ez izanik, Baina bai fase mugikorrarekin, fase mugikorrarekin batera eluitzeko. Kromatografian fase mugikorraren seinale-intentsitatea= hartzen da, erreferentzia bezala erabiltzen baita. tR= Erretentzio denbora; Osagaiak kromatografia zutabea zeharkatzeko behar duen denbora totala, denbora hori eluato kontzentrazio handiena atera den momentuan (Tontorrean) neurtzen da. tM berdina da kromatografiako osagai guztientzat, erabilitako fase geldikorra, kromatografia zutabea eta fase mugikorra berdinak badira.
Eluente = Fase Mugikorra, fase mugikorra kromatografia zutabean zehar ponpa peristatikoen bitartez bultzatzen da, kromatografia azkarragoa izan dadin. Fase mugikorrarekiko atxikimendu handiena duen analitoa = horia Fase geldikorrarekiko erretentziorik izango ez balu mugan egongo litzateke osagai horia. Zenbat eta beherago egon orduan eta fase geldikorrarekiko atxikipen handiagoa. Solvent = fase mugikorra, kapilaritatez gorantza banantzen ditu analitoak, fase mugikorrarekin atxikimendu handia duten analitoek. Geruza meheko kromatografia (Thin Layer Chromatography) Adsortzioan oinarritutako kromatografia mota bat da. Fase Geldikorra beira, plastiko edo aluminiozko xafla batean eusten da; euskarri inerte deitzen zaie hauei, kromatografian eraginik ez daukatelako. Fase Geldikorra silika-gela edo aluminio oxidoa izaten dira batik bat. Fase Geldikorrarekiko analitoek adsortzioa dute, berriz Fase Mugikorrarekiko disolbagarritasunak lotzen ditu. Paper-kromatografia: Fase Geldikorra papera den Geruza meheko kromatografia mota bat da. Erretentzio-faktorea zenbat eta handiagoa izan orduan eta handiagoa da Fase Mugikorrarekiko atxikipena. Erretentzio-faktorea (Rf): Rf =Analitoak kromatografian egindako distantzia (Banatu ostean) Fase Mugikorrak egiten duen distantzia maximoa Zutabe kromatografian fase geldikorra beira edo metalezko zutabe batetan enpaketatuta dago (edo hutsa izan daiteke); nahasketa gehitu eta fase mugikorra, eluentea deritzona, pasaraziko dugu (grabitatearen eraginez, punpa sistema batez edo gas‐presio a eraginez). Kromatografo oso zehatzak = HPLC (High Pressure / Performance Liquid Chromatography) erabilitako zutabeek kapilar (Ile) baten zabalera daukate analito kantitate txikiak eta abiadura oso handiak erabiliz egiten da kromatografia mota hau, oso zehatza izanik. Lagina kromatografia-zutabearen goikaldean (Ohantzean) jartzen da.
Geruza fineko
kromatografiaTLC, thin layer chromatographyZutabe^ kromat
eluzio‐flu
eluzio‐fluxua
kapilaritatea
2.- Banaketa kromatografia (Likido-Likido edo Likido-Gas) baita ere Partition Chromatography deitua. Analitoek nahastezinak diren 2 fase likidotan duten disolbagarritasunaren araberako kromatografia da, analitoa 2 likidoetan banatuko da Banaketa- Koefizientearen arabera (KD) Kromatografia zutabearen barnealdea euskarri inertez estalita daude, eta Fase Geldikorra den likidoa euskarri horri itsatsita dago, ondoren Fase mugikorra gehituz. Fase Mugikorra = Likidoa edo Gasa / Fase Geldikorra = Likidoa Banaketa kromatografia 2 motatakoa izan daiteke: Fase normaleko kromatografia likidoa (normal phase): Fase Geldikorra polarra da eta Fase Mugikorra berriz apolarra. Lehen eluitutako analitoa apolarrena da, berriz azken eluitutakoa polarrena da. Analito polarrak Fase Geldikorretik askatzeko Fase Mugikor apur bat polarragoa pasarazten da kromatografia zutabean zehar. Apur bat polarragoa den Fase Mugikor hori sortzeko Fase Mugikor apolarrari kontzentrazio txikietan Substantzia polarren bat gehitzen joaten zaio.
4.- Molekula-bazterketarako edo gel-iragazpeneko kromatografia (Permeazio-kromatografia / Exclusion chromatography edo gel filtration): Analitoak haien tamainaren arabera banatzen dira zutabe bat erabiliz. Erretxina bat den fase geldikor bat erabiltzen da, zeinek milioika bihi dituen, eta bihi hauetan tamaina desberdineko poroak dauden, Gel-iragazpeneko kromatografiako bereizketa-tartea ezarriz. Tamaina handieneko analitoak (KD=0) ezin dira bihietako poroetan sartu, ondorioz ibilbide laburragoa egiten dute, eluzio denbora txikiagoa izanik, baita eluzio bolumen txikiagoa ere. Berriz, analito txikiak (KD=1) bihietako poroetan sartu eta ibilbide luzeagoa egingo dutenez eluzio denbora eta bolumen handiagoa dute. Ve/Vo = Analitoen eluzio-bolumena bereizmen-tartetik kanpoko analito handiegiak edo txikiegiak zuzen barnean sartzen badira. Ve = Eluzio-bolumena bereizmen-tartetik kanpoko analitoak zuzenean agertzen ez badira. Lehen eluitzen den analitoaren eluzio-bolumena = Vo (Masa handiena [Edozein], bereizmen-tartetik kanpo). Azken eluitzen den analitoaren eluzio-bolumena kontuan ez hartu (Masa txikiena [Edozein], bereizmen-tartetik kanpo). Polaritatea Karga netoa Tamaina
Presio-baxuko kromatografia; Zutabe irekietan ematen da, eta fase mugikorra grabitatearen eraginez edo huts-ponpa baten bitartez bultzatzen da kromatografia- zutabean behera. Baita ere ponpa-peristaltiko baten bitartez gerta daiteke (Fase mugikorra bultzatzen du, fluxu zehatz bat zehaztuz). Erresoluzio baxua dauka Fase geldikorra solidoa da eta Fase mugikorra likidoa. Punpak kromatografia mota guztietan erabil daitezke kromatografia arinago gertatzeko. Ohiko likido-kromatografiak ez du eraginkortasun nahikorik, ondorioz HPLC (High performance/pressure liquid kromatography) erabiltzen da presio izugarria eraginik, kromatografia zutabe oso mehee eta luzeetan (Kapilareak), horrela eraginkortasuna, erresoluzioa eta kromatografiaren abiadura handituz. [Ppt]=nmol/L-ko kontzentrazioan dauden analitoan banatzeko, identifikatzeko edo kuantifikatzeko ahalmena du. Kromatografia hau lagin mota desberdinekin erabili daiteke: Farmakoak, elikagaiak, kosmetikoak… Erresoluzioa = Bereizmena; Antzekoak diren bi konposatu banatzeko ahalmena. Kromatografia-zutabea zenbat eta luzeagoa, eta bihi (poro) txikiagoak izan orduan eta erresoluzio handiagoa.
HPLC
zutabea Solbente jarioa Analitoen Injektorea
5.-Afinitate Kromatografia: Analitoen ezaugarri fisikoetan oinarritzen ez den kromatografia mota da, berriz, ezaugarri biologikoetan oinarritzen da. Kromatografia mota honetan, analizatu nahi diren analitoak erakarri egiten dira fase geldikorrera, honetan dauden ligando edo estekatzaile espezifikoen bitartez. Urdinez analitoa erakartzen duen ligandoa / Beltzez Banandu nahi den analitoa, hala ere bi norabideetan gerta daiteke, hau da, beltzez dagoena analitoa erakartzen duen ligandoa izan daiteke. Entzima sustratoa, inhibitzailea, kofaktorea… Antigorputza Antigenoa, birusa, zelula… (alpha)Anti–pTyr (Fosfotirosina). Lektina Polisakaridoak, glikoproteinak… Azido nukleikoak Sekuentzia-osagarriak (A-T,U / C-G), proteinak… Hormonak Bitaminak, hartzaileak… Glutation Glutation-S-transferasa, GST fusio proteinak… Metalak poli(His) fusio-proteinak, fosfo… 1.- Solbenteak 2.- Solbenteak desgasifikatu 3.- Gradiente-balbula 4.- Fase mugikor nahastua 5.- Presio altuko ponpa 6.- Injekzioa 7.- Injekzio loop-a 9.- Analisi-zutabea ligandoa Analitoa
10.- Detektorea 11.- Datu bilketa 12.- Hondakinak
