¡Descarga Transcriptómica: Sanger vs. RNA-seq Illumina - Prof. Vidal y más Apuntes en PDF de Biología solo en Docsity!
TRANSCRIPTÒMICA
Sanger / mRNA-seq Illumina
Arminda Navarro, Marina Perceval, Sara Gómez, María Mariño, Rita Roura, Ferran Nadal, Marc Montero, Noelia Morales, Xavier, Nil Naval, Olga Marquez, Esther Martínez
1. INTRODUCCIÓ
Cel·lularment la informació genètica xifrada en l'ADN i continguda en els gens s'expressa a través dels mecanismes de transcripció i traducció , a partir del qual es produeixen molècules d'ARNm i proteïnes, respectivament. El coneixement del transcriptoma i la seva regulació és fonamental per a la interpretació articulada dels diversos constituents moleculars que integren la xarxa de resposta gènica davant un determinat esdeveniment inductor. Per tal de “desxifrar” tota aquesta xarxa d’informació i mecanismes avui dia tenim a l’abast tècniques com la sequenciació de SANGER (més senzilla i limitada en quant a la informació que n’obtenim) o l’RNA-seq d’Illumina (més avançada, complexa i de resultats més complets), els mètodes i finalitats dels quals explicarem.
2. SEQÜENCIACIÓ PEL MÈTODE DE SANGER
El mètode de seqüenciació de SANGER és una PCR modificada i procedeix de la següent manera:
Per seqüenciar un fragment de DNA, es necessita:
- el DNA que es vol seqüenciar.
- el primer complementari al fragment de DNA que es seqüenciarà.
- la Taq polimerasa.
- Els quatre nucleòtids: A,T,G,C (dNTPs).
També hi afegim didesoxinucleòtids (ddNTPs), que tenen una estructura química lleugerament diferent de la dels nucleòtids normals. En aquests didesoxinucleòtids els manca el grup hidroxil del carboni 3', de manera que quan un d'aquests nucleòtids s'incorpora a la cadena de DNA en creixement aquesta no pot continuar l'elongació. Això és degut a que la DNA-polimerasa necessita un grup terminal 3' -OH per afegir el següent nucleòtid.
Per començar la reacció de seqüenciació s'escalfa una mescla amb tots els components necessaris fins al punt en que les dues cadenes de DNA es separin. Posteriorment es disminueix la temperatura per facilitar que el primer trobi la seqüència
complementaria a la cadena de DNA. Finalment la temperatura es torna a augmentar lleugerament. Això permet a l'enzim Taq-polimerasa unir-se al DNA i crear una nova cadena complementària.
L'enzim no fa distinció entre dNTPs i ddNTPs. Cada vegada que s'incorpora un ddNTP la síntesi s'atura, ja que després d'un ddNTP no s'hi pot afegir un altre nucleòtid. Degut a que bilions de molècules de DNA es troben al tub de la reacció, la cadena pot ser finalitzada a qualsevol posició. En conseqüència s’obtenen moltes cadenes de DNA de longituds diferents finalitzades per diferents ddNTPs.
La mescla resultant d’aquesta reacció es transfereix a un gel d'electroforesi, i es col·loca en un seqüenciador per analitzar els resultats. En el gel els diferents fragments resultants migraran d'acord amb la seva mida. Cadascun d'aquests fragments serà detectat per un feix de llum làser a la base del gel.
Cada tipus de ddNTP emet una llum amb una longitud d'ona característica que és registrada com una banda de color en una imatge simulada. L'ordinador interpreta aquestes dades i les mostra com un electroferograma ( Fig 1 ) on els pics de color representen cada una de les lletres de la seqüència.
D’aquesta manera, ja tenim el nostre fragment de DNA seqüenciat, gràcies a les diferents mides dels fragments de DNA resultants de la PCR amb els ddNTPs, que ens han permés establir l’ordre dels nucleòtids.
Figura 1: Esquematització visual del mètode de Sanger
https://www.dnalc.org/resources/animations/cycseq.html (animació de com funciona SANGER)
3.1. TÈCNICA Illumina
La seqüenciació Illumina es basa en una PCR pont i té com a base la miniseqüènciació (fig.2). La miniseqüenciació consisteix en determinar a partir d’un producte de PCR un polimorfisme ( presència de més d'una variant al·lelica per a un determinat gen, bé sigui en una població o espècie) conegut d’aquell fragment, es coloca el primer just abans del polimorfisme i s’espera que s’hi afegeixi el ddNTP que determinarà quin nucleòtid ocupa aquella posició.
Figura 3. Inici de la seqüenciació d’illumina. Unió dels adaptadors i PCR pont
Abans de la seqüenciació, cal purificar l’RNAm (producte de la transcripció en un moment determinat), per convertir-lo posteriorment a cDNA en un termociclador. Després aquest cDNA resultant serà purificat i ja es podrà procedir al seu ús per a fer la seqüenciació mitjançant la tècnica d’Illumina.
En la seqüenciació Solexa Illumina, el genoma es talla en fragments i se li afageixen adaptadors (regions del genoma conegudes). Es lliguen els adaptadors de tal manera que cada fragment generat contindrà un adaptador lligat en els seus extrems 3'y 5'. Les seqüències de aquests adaptadors es coneixen i seran necessàries per que cada fragment pugui ser seqüenciat.
Aleshores es tracta de que aquests fragments s’uneixin a una coberta de primers que són complementaris als adaptadors afegits anteriorment. Hi ha dos tipus d’adaptadors (oligonucleòtids), que corresponen a les dues seqüències terminals a cada extrem dels
segments de cDNA que volem seqüenciar. Seguidament es fa una PCR pont per síntesi (fig.3), s’obté la cadena complementària, i es generen clústers (grups de fragments iguals o complementaris). Un cop units els segments als oligonucleòtids, es realitza una “amplificació per pont”. Els segments de cDNA units per un extrem es dobleguen i uneixen l’extrem lliure al seu adaptador corresponent, formant un “pont” entre els dos oligonucleòtids. Les polimerases actuen sobre aquests “ponts” creant la seva cadena complementària. La doble cadena resultant es denaturalitza per separar les dues cadenes les quals s’uneixen per separat als adaptadors. Aquest procès es repeteix fins que a partir de unes poques cadenes es creen clústers (agrupacions de moltes cadenes). Un cop generats els clústers, s’ha de determinar la seqüència de bases. Per fer-ho s’afegiran ddNTP marcats fluorescentment però a diferència de la seqüenciació de SANGER aquests són reversibles. En un primer moment només es podrà enganxar un dideòxinucleòtid (ddNTP) per veure quina llum emet i determinar el nucleòtid que ocupa aquella posició, i seguidament es modificarà el ddNTP unit i es podrà afegir el següent, i així successivament fins a tenir la seqüència complerta. Una càmera fotogràfica captarà la llum emesa per cadascuna de les posicions en la seqüència i aquesta es registrarà en l’ordinador (fig.4).
un COVERAGE elevat (nombre de vegades que es llegeix un fragment), per si es produeixen errors en la PCR.
Figura 5: Construcció de la seqüència consens a travès del solapament dels fragments.
https://www.youtube.com/watch?v=womKfikWlxM (animació de comfunciona Illumina)
4. CONCLUSIONS
Les diferències entre una tècnica i l’altre queden recollides a la següent taula:
SANGER SOLEXA ILLUMINA
Quantitat de fragments seqüenciats a la vegada
1 Molts (seqüenciació massiva)
Detecció de duplicació gènica
No Sí, trobem un coverage més elevat en els fragments duplicats
Tipus de seqüenciació Seqüenciació de novo, es pot seqüenciar de 0.
Ressequenciació, necessita genoma de referència
Resolució Resolució més alta que en Illumina tot i que també és limitada.
Poca resolució, com més llarg és el fragment més díficil és d’alinear
Nucleòtids ddNTP i dNTP Únicament ddNTP
Taula 1. Diferències entre seqüenciació de Sanger i Solexa Illumina
