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TEMA 14: CLASIFICACIÓN Y FILOGENIA
Importancia de la sistemática: necesidad de ordenar los MO (académicamente, entender conceptos, y prácticamente, actuar ante casos prácticos como patologías, la identificación de MO presentes en la industria, como las fermentaciones...). Se dan dificultades en la ordenación de objetos microscópicos. Por ello tradicionalmente se emplea la comparación de otras propiedades fenotípicas: tamaño, forma, movimiento, propiedades de las colonias, olor, color, obtención de energía, versatilidad metabólica, sensibilidad a antibióticos, resistencia a metales, sensibilidad al oxígeno, presencia de compuestos singulares...
Versatilidad en la obtención de energía -Quimiótrofos (quimioheterótrofos o quimiolitótrofos). -Fotótrofos.
Color Con pigmentos verdes, rosados... lo que influye en las longitudes de onda en las que absorben la energía.
Morfología Se dan casos característicos, como formas filamentosas en MO que no se dividen al crecer.
Cianobacterias presentan células diferenciadas especializadas en fijar nitrógeno: son fotosintéticas con 2 centros de reacción, y la célula diferenciada actuará como NITROGENASA. Se da permeabilidad entre las distintas células, con un mismo ADN, para transmitir compuestos.
Colonias Micoplasmas: carecen de pared celular y al crecer en forma de colonia forman un ''huevo frito''.
Movimiento Espiroquetas, estructuras muy complejas que se mueven por reptación, de modo diferente al movimiento GROWNIANO.
Relaciones simbióticas. Líquenes, con nomenclatura peculiar y distinta a la de los individuos por separado.
¿Cómo operar?
Ya que los MO son un 80% agua, su identificación es muy compleja al microscopio. Se realizan por ello TINCIONES para visualizarlos. Los fijamos mediante CALOR en un porta y se pone en contacto con la solución que los teñirá, ya sea simple o diferencial. Retiramos el exceso y observamos al microscopio para determinar forma, tamaño... etc.
Se darán propiedades de interés QUIMIOTAXONÓMICO con las que distinguimos bacterias eucariotas de ARQUEAS, como la presencia de un ENLACE ÉSTER LÁBIL a la hidrólisis con NaOH y un ENLACE ÉTER que resiste al compuesto, respectivamente.
Otra propiedad característica es la FORMACIÓN DE ENDOSPORAS. Sólo se da en GRAM +, y dentro de ellas en Bacillus y Chlostrydium. Éstos se distinguen entre sí porque los primeros toleran el oxígeno y los segundos son estrictamente anaerobios.
Ordenación analítica del estudio de propiedades fenotípicas
Construimos UNA MATRIZ DE DATOS FENOTÍPICOS con n propiedades, pudiendo analizar dichas propiedades en los distintos MO a estudiar. Dicha matriz puede transformarse en un CLADOGRAMA mediante el cual matemáticamente podemos calcular el grado de similitud entre los MO comparados. Este sistema se ha empleado hasta los años 90. Posteriormente se emplean los GENOTIPOS con las metodologías desarrolladas.
Hoy en día no se utilizan los CLADOGRAMAS FENOTÍPICOS, sino propiedades genotípicas.
A más propiedades analizadas en la matriz fenotípica mayor grado de precisión en la comparación obtendremos.
Ejemplo de procedimiento:
Aislamos un MO del intestino de un animal de sangre caliente. Empleamos un cultivo AXÉNICO y aplicamos TINCIÓN DE GRAM para distinguir los dos grandes grupos de bacterias. Observaremos su morfología, relación con el oxígeno, tipo de sistemas de obtención de energía y sus peculiaridades, compuestos que produce característicos, y otras propiedades que podemos deducir mediante una colección de reacciones a las que sometemos al MO puro. Conocidas todas estas propiedades buscaremos el candidato que mejor encaja con estas características.
Si detectáramos un MO en un ambiente donde supuestamente no habita, puede tratarse de una MARCA DE CONTAMINACIÓN.
Concepto de ESPECIE:
La definición clásica (sólo aplicable a organismos que tengan reproducción sexual) dicta que la constituyen organismos con capacidad de tener DESCENDENCIA FÉRTIL.
Resulta IMPOSIBLE de aplicar a MO, especialmente a los procariotas. Surge la necesidad de disponer de un sistema de CLASIFICACIÓN UNIVERSAL: grupo de CEPAS (=aislados) que tienen:
- Un elevado número de propiedades fenotípicas comunes, y que:
- A nivel genotípico (secuencia de rDNA, 16S para procariotas y 18S para eucariotas) tienen una homología de secuencia IGUAL O MAYOR que el 97% y a nivel de hibridación una capacidad igual o mayor que el 70%. En este segundo caso no sólo observamos el gen en cuestión del rDNA sino el resto de genes del genotipo, que se miden por TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN para determinar su homología de secuencia: dicha técnica determina su CAPACIDAD PARA FORMAR HÍBRIDOS.
Si cumple el primer porcentaje es suficiente para definir la especie, pero queda abierto un problema si no se alcanza el 70% a nivel de hibridación. El ARNr es de mayor categoría para definir la especie que el nivel de hibridación.
Concepto de GÉNERO.
Constituido por un GRUPO DE ESPECIES relacionadas con una HOMOLOGÍA A NIVEL DE rDNA IGUAL O MAYOR DEL 93%. No consideramos la hibridación porque en este caso será muy baja.
Los géneros se agrupan en FAMILIAS, estas en ÓRDENES, los órdenes en CLASES, las clases en FILUMS y los FILUMS en DOMINIOS.
En este caso el criterio de homología a nivel de rDNA no existe y es altamente variable. El criterio se basará en propiedades FENOTÍPICAS.
Propiedades genotípicas:
A lo largo de la historia los conceptos han ido evolucionando parejos a la evolución tecnológica. El primer concepto fue la identificación de ácidos nucleicos como zona de almacenaje de información, y posteriormente como responsable de la expresión de las propiedades fenotípicas.
CHARGAFF: reglas de complementariedad. Químico, en su época se descubre que los ácidos nucleicos son los responsables del almacenamiento de material genético. Determina la existencia de 4 bases en los ácidos nucleicos y empleando CROMATOGRAFÍA EN PAPEL identifica la cantidad de cada base. La de G era igual a la de C y la de A
Se descubren las ENZIMAS DE RESTRICCIÓN, ''tijeras'' que cortan el genoma en secuencias muy conservadas (extendidas), lo que permite el desarrollo de la técnica de clonación: en una célula procariota, con su CROMOSOMA y sus PLÁSMIDOS AUTORREPLICATIVOS. Cortar los plásmidos con una enzima de restricción y unir dentro de él un gen cortado de un cromosoma, los plásmidos se copian n veces con el gen en cuestión multiplicado y éste puede ser de nuevo extraído y secuenciado.
Con esta tecnología es ya posible extraer la secuencia completa del rRNA. Se obtienen así resultados novedosos: la antigüedad de las ARQUEAS es menor que la de las BACTERIAS (pierden el nombre de Eubacteria). Perderán la denominación de reinos pasando a ser DOMINIOS. Hoy en día clasificamos a los organismos en estos 3 grandes dominios, BACTERIA, ARQUEA Y EUCARIOTA. Se han obtenido así similitudes entre arqueas y eucariotas que no se detectaron a nivel del catálogo de oligonucleótidos. SE ESTABLECE ASÍ UNA ORDENACIÓN FILOGENÉTICA O EVOLUTIVA, ya que está basada en INFORMACIÓN DE SECUENCIA de un RELOJ EVOLUTIVO.
La introducción de la técnica PCR (aislamiento de una POLIMERASA de Thermus thermus y desarrollo de la reacción de la polimerasa en cadena ). Se obtienen secuencias de genes sin necesidad de clonar a mucha mayor velocidad y menor coste por acción de una enzima.
La DNA polimerasa ha de ser TERMÓFILA porque es necesario CALENTAR para separar las hebras, lo que haría necesario añadir una nueva enzima en cada ''ronda'' de replicación si no lo fuese. Se disponen CEBADORES en la hebra para marcar el gen de interés.
Se busca posteriormente secuenciar el genoma a base de pequeñas porciones de éste que se ordenan mediante un programa informático: este proceso es desarrollado por CRAIG VENTER, que secuencia el genoma de Mycoplasma, E. Coli, el genoma humano...
La evolución de las técnicas y conceptos se han apoyado a lo largo de la historia en el avance tecnológico.
A partir de células puras podemos extraer el ADN y tomar el gen de interés, que amplificaremos por PCR añadiendo CEBADORES para que la polimerasa no copie todo el ADN. Con las copias suficientes se secuencia dicho gen, para alinearlo y compararlo con el fin de CALCULAR LAS DISTANCIAS EVOLUTIVAS, que parten de ser numéricas y se establecen en el ÁRBOL FILOGENÉTICO.
Hibridación.
Separamos las hebras de ADN con temperatura y se MARCAN con marcadores FLUORESCENTES (antes se empleaban radiactivos).
A continuación mezclamos las hebras entre sí. Consigo mismo, obviamente, se da un 100% de hibridación. La hebra 1 al mezclarse con la hebra 2 (siempre pondremos la 1 en exceso) genera híbridos en gran proporción, pero se dan regiones del genoma que no encuentran correspondencia y quedan sueltas. 75% de homología, 75% de su genoma es IGUAL.
1 con 3 formará menor número de híbridos (25%9, y la homología será aún menor entre 1 y 4 (7%).
Dos MO son de la misma especie cuando se da una homología de secuencia de rDNA mayor al 97% y su valor de hibridación será mayor o igual al 70%, 1 y 2 son de la misma especie.
Desarrollos actuales de interés taxonómico: PROTEÓMICA y GENÓMICA
La proteómica extrae las proteínas de la célula y se separan por electroforesis bidimensional, obteniéndose todas las proteínas del MO y pudiendo medirse la expresión proteica diferencial de un MO sometido a condiciones distintas, como variando la T. Ciertas proteínas se expresarán en ambos casos y otras se expresarán diferencialmente o no se expresarán en un caso determinado.
La comparación puede hacerse también con ADN, o empleando ARRAYS DE ANTICUERPOS.
Métodos automatizados para identificar MO: perfil de ácidos grasos (FAME: fatty acid methyl ester analysis).
Muy empleado en la industria, actúa a gran velocidad. De un cultivo axénico de bacterias se extraen las membranas y de ellas los ácidos grasos. Producimos una reacción química para facilitar la separación cromatográfica de los ácidos grasos. Se disponen en un CROMATÓGRAFO DE GASES, por la reacción al elevar la temperatura los AG se
