Función barrera intestinal, Apuntes de Bioquímica

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Función Barrera Epitelial en un Modelo de

Disfunción Intestinal Inducido por Parasitosis

con Trichinella spiralis en la Rata

Joan Antoni Fernández Blanco

La Dra. Patrocinio Vergara Esteras , Catedrática de Fisiología del Departamento de Biología Celular, de Fisiología y de Inmunología de la Universidad Autónoma de Barcelona y el Dr. Vicente Martínez Perea , Profesor Titular del Departamento de Biología Celular, de Fisiología y de Inmunología de la Universidad Autónoma de Barcelona HACEN COSTAR: Que la memoria titulada “ Función Barrera Epitelial en un Modelo de Disfunción Intestinal Inducido por Parasitosis con Trichinella spiralis en la Rata ” presentada por JOAN ANTONI FERNÁNDEZ BLANCO para optar al grado de Doctor se ha realizado bajo su dirección y, al considerarla concluida, autorizan su presentación para ser evaluada por el Tribunal correspondiente. Y, para que conste a los efectos oportunos, firman el presente documento. Bellaterra (Cerdanyola del Vallès) a 28 de setiembre de 2012 Dra. Patrocinio Vergara Esteras Dr. Vicente Martínez Perea

La imagen que aparece en portada es una microfotografía de obtención propia realizada en microscopía óptica de campo claro. En ella se pueden observar diversas células que expresan la triptasa rMCP-6, correspondientes a mastocitos de tejido conectivo, infiltrando la capa muscular longitudinal del yeyuno de una rata Sprague Dawley OFA transcurridos 30 días tras su parasitosis porTrichinella spiralis.

claro que es más importante ser buena persona que buen investigador y por descubrirme el Jägermeister. A Sandra, por los repetidos intentos de completar mis trabajos con el FISH y por “obligarme” a vivir largas noches en Get Back. A Elena Tapia, por su espíritu luchador, su punto de vista crítico y compartir el mundo Mercadona. A la Marina, la Míriam, Elena Eyre, Carlos Bielsa y Carlos Grau por su contribución al grupo como becarias y/o residentes. Gracias a los técnicos y administrativos de la Unidad de Fisiología. A Emma, por su ayuda, especialmente con las IHQs y el baño de órganos, por hacer de DJ e interesarse por lo que hacía en todo momento. A Antonio, por su ayuda con los animales, los pedidos y el curso de categoría C. A David, por tener siempre la puerta abierta para cualquier gestión, su amabilidad y su educación. También quiero darle las gracias al Departamento de Farmacología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Granada. En el breve periodo que compartimos, me hicieron sentir plenamente integrado desde el primer día. Merecen una mención especial Isabel y el Dr. Fermín Sánchez de Medina. Su ayuda fue fundamental a la hora de concluir con la odisea en que se había convertido la puesta a punto de las cámaras de Ussing. Además, este último contribuyó en el que fue mi primer manuscrito científico como primer autor. A su vez, me gustaría agradecerle al grupo de la Dra. Terez Shea‐Donohue y el Dr. Aiping Zhao del Mucosal Biology Research Center de la Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland que me brindaran la oportunidad de hacer una estancia en su laboratorio. Gracias a ellos, pude introducirme en los apasionantes campos de la captura por microdisección láser, de la PCR y de los cultivos celulares. A su vez, debo agradecerles el excelente trato personal que me brindaron en todo momento. Del mismo modo, quiero darles las gracias a todos los miembros del Servei d’Estabulari de la UAB, desde Jordi Cantó hasta cada uno de los técnicos. Gracias por todo lo que me habéis enseñado y por mantener la colonia de ratones parasitados sin la cual esta tesis no habría sido posible. En este sentido, también quisiera rendirles un sentido homenaje a todos los animales y “paràsits mil∙lenaris” que participaron en los estudios llevados a cabo a lo largo de estos años.

A los miembros del CReSA, debo agradecerles su ayuda en el aprendizaje de la fluorimetría y las lecturas de absorbancia. Gracias al Departamento de Anatomía de la Facultad de Veterinaria y al Instituto de Neurociencias de la UAB por haber hecho posibles las fotografías de campo claro que aparecen en este manuscrito. También me gustaría agradecerles a los miembros del tribunal de esta tesis que aceptasen la invitación y el esfuerzo realizado al respecto. No me puedo olvidar de los amigos de toda la vida con los que he compartido tantas experiencias. Especialmente quiero darles las gracias a Álex y a Checho. Porque ya sea en la Madre Rusia, en Cádiz o a la vuelta de la esquina siempre es un placer pasar un rato a su lado. Porque gracias a las pequeñas locuras vividas junto a ellos me he mantenido más cuerdo. La familia, no cabe duda, merece una mención especial. A Abel quiero agradecerle que me obligase a ser fuerte y tener un espíritu de superación constante. A Héctor le debo dar las gracias por su gran corazón, su sentido del humor y permitirme estar a su lado presenciando el gran salto personal que ha dado durante estos últimos años. A mis padres, en primer lugar, les debo dar las gracias por estar siempre a mi lado y enseñarme lo que significa el amor incondicional. Ellos han sido y siguen siendo mi referente más claro, un ejemplo a seguir tanto en al ámbito personal como en el laboral. Mi cultura del esfuerzo y del trabajo bien hecho se la debo a ellos. También quiero acordarme de los demás miembros de mi familia y especialmente los que no están a nuestro lado en el día de hoy, como son mis abuelos. Tampoco está ya entre nosotros Platón. Él fue sin duda uno de los motivos que me alentó a estudiar veterinaria, permitiéndome posteriormente realizar los estudios de doctorado. Per últim voldria donar‐li les gràcies a l’Elisabet. Perquè sent com és, autèntica i espontània, m’ha dibuixat un somriure a la cara dia rere dia durant tots aquests anys. Per la seva generositat, fent‐me costat en els moments més durs, sense importar la distància. Per creure en mi i en nosaltres per sobre de totes les adversitats. En definitiva, li vull donar infinites gràcies per estimar‐me i deixar‐se estimar.

“From contemplation one may become wise, but knowledge comes only from study” Alfred Edward Newton (1864‐1940), escritor norteamericano.

• ABREVIATURAS..............................................................................................................................
• RESUMEN
• SUMMARY
• INTRODUCCIÓN.............................................................................................................................
  • Estructura y Funciones Intestinales
    • Anatomía e Histología del Intestino Delgado........................................................................
    • Función Barrera Intestinal.....................................................................................................
    • Motilidad Intestinal
    • El Sistema Inmune Intestinal...............................................................................................
  • Enfermedades Inflamatorias y Funcionales del Tracto Gastrointestinal
    • Enfermedad Inflamatoria Intestinal (IBD)
    • Enfermedades Funcionales Gastrointestinales: Síndrome del Intestino Irritable (IBS)
    • Modelos Animales de IBD y de IBS......................................................................................
  • Las Mastocitos (Mcs)...............................................................................................................
    • Mecanismos de Activación de los Mastocitos
    • Proteinasas Mastocitarias: Clasificación de los Mastocitos e Implicaciones Funcionales
    • Métodos de Estudio de las Funciones Mastocitarias..........................................................
    • Los Mastocitos en la IBD y el IBS
• HIPÓTESIS Y OBJETIVOS...............................................................................................................
• CAPÍTULO
• DYSFUNCTION PERSISTENT EPITHELIAL BARRIER ALTERATIONS IN A RAT MODEL OF POSTINFECTIOUS GUT
• CAPÍTULO
• AND LATE PHASES OF POSTINFECTIOUS GUT DYSFUNCTION IN THE RAT.................................. PAR‐ 2 ‐MEDIATED CONTROL OF BARRIER FUNCTION AND MOTILITY DIFFERS BETWEEN EARLY
• CAPÍTULO
• A RAT MODEL OF GUT DYSFUNCTION INDUCED BY TRICHINELLA SPIRALIS INFECTION DYNAMICS OF MAST CELL SERINE PROTEINASES AND TIGHT JUNCTIONS‐RELATED PROTEINS IN
• DISCUSIÓN GENERAL.................................................................................................................
• CONCLUSIONES
• REFERENCIAS.............................................................................................................................
• PUBLICACIONES Y PARTICIPACIÓN EN CONGRESOS

1 ABREVIATURAS 5 ‐HT : 5 ‐hidroxitriptamina, 5 ‐hydroxytryptamine ; serotonina, serotonin ACh : Acetilcolina AJ : Unión adherente, a dherens junction AUC : Área bajo la curva, area under the curve CCh : Carbacol, carbachol CD : Enfermedad de Crohn, Crohn’s disease cDNA : DNA complementario, complementary DNA Cq : Ciclo de cuantificación, quantification cycle CRH : Hormona liberadora de corticotropina, corticotropin‐releasing hormone CTMC : Mastocito de tejido conectivo, connective tissue mast cell DNA : Ácido desoxirribonucleico, deoxyribonucleic acid DNBS : Ácido dinitrobencenosulfónico, dinitrobenzene sulfonic acid EBF : Función barrera epitelial, epithelial barrier function EGTA : Ácido etilenglicol bis tetraacético, ethylene glycol tetraacetic acid ENS : Sistema nervioso entérico, enteric nervous system FcεRI : Receptor de alta afinidad para la IgE FD : FITC conjugado con dextrano, FITC‐labeled dextran FITC : Isotiocianato de fluoresceína, fluorescein isothiocyanate G : Conductancia, conductance IBD : Enfermedad inflamatoria intestinal, inflammatory bowel disease IBS : Síndrome del intestino irritable, irritable bowel síndrome IFN‐γ : Interferón γ, interferon γ Ig : Inmunoglobulina, immunoglobulin IL : Interleuquina, interleukin Isc : Corriente de cortocircuito, short‐circuit current JAM : Moléculas de adhesión de la unión, junctional adhesion molecules MC : Mastocito, mast cell MC‐CPA : carboxipeptidasa A mastocitaria MLCK : Quinasa de la cadena ligera de la miosina, myosin light chain kinase

3 RESUMEN La función barrera intestinal constituye la primera línea de defensa del tracto digestivo. Ésta se ve condicionada por el transporte hidroelectrolítico, la permeabilidad y la motilidad intestinales. Alteraciones de estas funciones favorecen la estimulación continua, por antígenos y microorganismos luminales, del sistema inmune local llevando a estados inflamatorios más o menos crónicos. Estos cambios parecen caracterizar diversas patologías inflamatorias y funcionales gastrointestinales, incluyendo la enfermedad inflamatoria intestinal y el síndrome de intestino irritable. Los mastocitos (MCs), a través de un proceso de activación y liberación de mediadores neuroinmunes, participan como células efectoras en la respuesta inmune asociada a estas enfermedades. Este trabajo profundiza en las implicaciones de los MCs en las disfunciones intestinales, haciendo un especial énfasis en la función barrera. Para ello, se empleó un modelo de parasitosis por Trichinella spiralis en ratas. Tras la infección, se observó la evolución temporal (días 2 a 30 post‐infección) en las poblaciones de MCs de mucosa y de tejido conectivo en el yeyuno. Las variaciones en los infiltrados mastocitarios se acompañaron de una sobreexpresión en las proteinasas mastocitarias. Las proteinasas, actuando como enzimas sobre sustratos específicos, incluyendo la activación de receptores activados por proteinasas (PARs), regulan las funciones secretomotoras y sensoriales gastrointestinales. Acompañando estos cambios, se han caracterizado remodelaciones neuroepiteliales post‐infecciosas que resultan en una alteración de la función barrera, en concreto: una alteración de la secreción hidroelectrolítica basal, de la respuesta a secretagogos y en el incremento de la permeabilidad intestinal. Estas disfunciones de la barrera tienen como base cambios temporales específicos en la expresión de proteínas de las uniones estrechas intercelulares. A su vez, la parasitosis produjo un aumento de la actividad motora espontánea intestinal, en parte mediada por los MCs, ya que se revierte parcialmente en animales tratados con el estabilizador mastocitario ketotifeno. Por otro lado, las respuestas secretoras intestinales a la degranulación mastocitaria y a la activación de PAR‐ 2 se vieron reducidas en la fase post‐infecciosa (día 30 post‐infección). Si bien, ello sugeriría una desensibilización epitelial a los mediadores mastocitarios, la estabilización de los MCs con ketotifeno no tuvo efectos sobre las respuestas secretoras basales o mediadas por PAR‐ 2 ni sobre los incrementos post‐infecciosos en la permeabilidad. En resumen, hemos definido los cambios en las poblaciones mastocitarias y la función barrera intestinal, así como su relación con la expresión de proteínas de uniones intercelulares y con la expresión de PAR‐ 2 y sus efectos secretores en un modelo de disfunción intestinal post‐infecciosa. Aunque estos datos apoyan una implicación de los MCs en los cambios morfo‐funcionales asociados a la infección cuestionan una participación directa de los mismos en la función barrera intestinal. Mecanismos de regulación similares pueden operar en enfermedades inflamatorias y funcionales gastrointestinales.

4 SUMMARY Epithelial barrier function is considered part of the defensive mechanisms of the gastrointestinal tract. Barrier function results from an interplay of at least three components: hydroelectrolytic transport, permeability and intestinal motility. Alterations of these functions favor a state of luminal antigens‐ and microorganisms‐ dependent stimulation of the local immune system, leading to an inflammatory‐like stage. These changes are common to several gastrointestinal pathologies, including inflammatory bowel disease and irritable bowel syndrome. Mast cells (MCs), throught a process of activation and release of endogenous neuroimmune mediators, act as effector cells in the neuroimmune responses associated to these alterations. This work aims the characterization of MCs’ implications in gastrointestinals dysfunctions, with emphasis in barrier function. For this, we used a model of Trichinella spiralis infection in rats. After the infection, time‐related (days 2 to 30 postinfection) changes in mucosal and connective tissue MCs were assessed in the jejunum. Changes in MCs infiltrates occurred together with an up‐regulation of proteinases gene expression. MC‐derived proteinases, throught the enzymatic cleavage of specific substrates, including proteinase‐activated receptors (PARs), regulate gastrointestinal secretomotor and sensory functions. In addition, we characterized postinfectious neuroepithelial remodelations, leading to functional changes in barrier function. In particular, alterations in basal electrolytic secretion, secretory responses to secretagogues and an increase in epithelial permeability were observed. These barrier dysfunctions are associated to time‐related changes in the expression of tight junctions‐related proteins. In parallel, an increase in spontaneous intestinal motor activity was also observed. Treatment with the MC stabilizer ketotifen partially prevented these motor alterations, thus suggesting that MCs are implicated, at least partially, in these responses. In addition, secretory responses to MCs degranulation and PAR‐ 2 activation were reduced during the postinfectious phase (day 30 postinfection). This might suggest a desensitization of the epithelium to MC mediators. However, treatment with the MC stabilizer ketotifen was without effect, thus suggesting the contribution of additional, MCs‐independent mechanisms. In summary, this work characterizes changes in MCs populations and epithelial barrier function in a model of postinfectious gut dysfunction in rats. Furthermore, the relationship with the expression of tight junction‐related proteins and PAR‐ 2 and its secretory effects was characterized. Overall, results obtained support an implication of MCs in the morphological and functional alterations associated to the infection. However, they also question a direct role of MCs in the control of epithelial barrier function. Similar mechanisms might operate in inflammatory and functional gastrointestinal disorders.