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Asignatura: Microbiologia, Profesor: Alumne Alumne, Carrera: Biologia, Universidad: UdG
Tipo: Apuntes
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Se denomina genoma de una especie al conjunto de información genética, codificada por un conjunto de nucleótidos los cuales constituyen el DNA, y que es necesaria para el correcto funcionamiento y el desarrollo de un organismo. Dependiendo del organismo, el DNA puede ser una doble cadena en forma de hélice o circular. En otros organismos, como los virus, en lugar de en el DNA, la información puede estar codificada en el RNA. En estos casos esta molécula se denomina cromosoma bacteriano y cromosoma vírico. En algunos casos, las bacterias poseen un DNA extracromosómico, también circular y cerrado, denominado DNA plasmidico. Estos últimos, aunque poseen información necesaria para algunas funciones, no son esenciales para la célula en condiciones normales de crecimiento. Los procariotas contienen un solo conjunto de genes, es decir, son haploides (n); mientras que, los microorganismos eucariotas suelen tener dos juegos de genes, son diploides (2n). Es importante diferenciar que, el conjunto de genes se denomina genotipo, mientras que el conjunto de genes que se expresan en su exterior se denomina fenotipo, ya que no todos los genes se expresan al mismo tiempo.
El genoma mínimo es un conjunto de genes reducido suficiente como para mantener una forma de vida celular funcional en condiciones ambientales favorables, o sea, en presencia de nutrientes esenciales y sin estrés ambiental.
La primera comparación, entre los genomas de Haemophilus influenzae y Mycoplasma genitalium, se sugiere que, aproximadamente, 250 genes se conservaban entre las dos especies filogenéticamente divergentes. Un análisis computacional posterior, que incluía los genomas de M. Genitalium y del parásito unicelular Rickettsia prowazekii y Chalamydia trachomatis , sugería que solo 156 genes estaban conservados, entre los genomas bacterianos, y que no más de 81 de estos estaban universalmente conservados.
De manera general, las bacterias tienen un genoma más extenso a medida que su estilo de vida se hace más complejo, como Rhizobium (6.000 genes aproximadamente). A su vez, las bacterias parásitas intracelulares reducen su genoma, ya que obtienen muchos de sus requerimientos de la bacteria huésped. Mycoplasma genitalium es una de las bacteria con el genoma más pequeño (574 genes) y se descubrió que 100 de estos genes no son esenciales en condiciones óptimas de laboratorio, lo cual no indica cuales de esos 100 genes son prescindibles simultáneamente. Así mismo, el genoma de Mycoplasma mycoides es la madre informática de la célula artificial, ya que contiene más de un billón de bases y más de 400 genes.
Albert Libchaber y su equipo de Rockefeller University están intentando diseñar la célula mínima, por el método de una “célula vacía” e introduciendo genes y componentes esenciales poco a poca, hasta conseguir que sobreviva sola. Implantando hasta 15 genes han conseguido que la célula tenga capacidad excretora. Aunque todavía no se han conseguido llevar a cabo todas las funciones esenciales de una célula.
Por otro lado, el equipo de Craig Venter intentan invertir este proceso, es decir, conseguir construir la primera célula sintética de la historia utilizando modificaciones de Mycoplasma spp. Para ello, se propuso sintetizar los genomas mínimos por síntesis química e introducirlos en las
células, comprobando así la capacidad de las funciones esenciales de los genomas utilizados. Por eso, aunque se ha considerado una célula sintética, lo único sintético es el genoma.
Cabe destacar que, es importante para el experimento establecer unos métodos adecuados y fiables. Por ello, los procedimientos empleados para la creación de un genoma fueron los siguientes.
1. Repartir la secuencia genómica en diferentes “fragmentos” de longitud limitada, sintetizar lo paquetes de forma independiente, verificar las secuencias y unir los paquetes. Se repartieron 580.076 pb de Mycoplasma spp. en 101 paquetes de 5 a 7 kb de longitud. 2. Insertar marcas de agua en los lugares intergénicos para diferenciar fácilmente el genoma sintético del genoma nativo. Las marcas de agua se utilizan para cifrar la información de las secuencias codificantes sin alterar los aminoácidos. 3. Modificar el gen que interese. El grupo de Craig y Venter introdujo 2514 pb en el gen MG408 para que la cepa no pudiera adherirse a células de mamíferos y, así, eliminar su virulencia. (14) 4. Unión de los “paquetes” de forma esquematizada. En el experimento se utilizaron 5 etapas (como puede observarse en la figura ¿?) para reunir todos los fragmentos del genoma artificial por recombinación in vitro y se unió al cromosoma de una bacteria artificial (BAC) de ADN vector para formar plásmidos recombinantes circulares con insertos del genoma sintético. 5. Utilización de enzimas de restricción para liberar el inserto de ADN. Se utilizaron las enzimas de restricción IIS, que cortan fuera de su lugar de reconocimiento (Not I) y, debido a que la cepa de Mycoplasma spp. utilizada no contiene lugares Not I, todos los fragmentos sintéticos se liberaron del BAC intactos. 6. Inhibición de la polimerasa T4 en ausencia de 2’-desoxirribonucleósido-5’-trifosfatos (dNTPs) para exponer las regiones de solapamiento. La polimerasa fue inactivada por incubación a 75ºC, y las uniones fueron reparadas por la Taq polimerasa y la ligasa en presencia de los 4 nucleotidos y NAD. Las muestras fueron sometidas a electroforesis de gel de inversión de campo (FIGE) para comprobar el éxito del ensamblaje. 7. Ensamblaje por recombinación in vivo en levadura. Cotransformación del DNA sintético y el DNA vector (pTARBAC3) para unirse por recombinación homóloga, produciendo clones circulares (clonación TAR), haciendo fácil la separación entre los cromosomas sínteticos y los cromosomas de la levadura (lineales). 8. Transformación y recuperación del genoma de Mycoplasma spp. Transformación de las células de levadura por el método (22) y recuperación del genoma sintético por aislamiento en agarosa, donde se eliminan los cromosomas de la célula huésped y se separa por electroforesis.
Con esto se demostrado que se puede sintetizar químicamente genomas y trasplantarlos en células de modo que sustituyan el genoma original y funcionen de manera autónoma, pero el reto es crear una células artificial con todos los componentes sintetizados in vitro. Una propuesta para el desarrollo de dicho experimento sería utilizar liposomas como membrana biológica (como hicieron Noireaux y Libchaber [17]) e introducir un conjunto mínimo esencial de proteínas sintetizadas in vitro para proveer los elementos necesarios para que el genoma artificial arranque e inicie su vida de forma independiente.