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ORGANIZACIÓN Y FUNCIÓN DE GENOMAS
Prácticas de laboratorio (bloque 2) Prof. responsable: Miguel Pita (lab. A201, [email protected])
Febrero de 2015 Laboratorio 02.PP.LD.S21-3. Edif Biología
Meiosis: observación de cromosomas de Ortóptero
En la presente práctica vamos a preparar y observar muestras de cromosomas de saltamontes de la especie Eyprepocnemis plorans. Las células se obtendrán a partir de folículos de gónadas de saltamontes, que han sido previamente fijadas en etanol:ácido acético (3:1). Emplearemos la técnica de aplastado ( Squashing ) para elaborar las preparaciones. Observaremos las preparaciones al microscopio óptico mediante contraste de fases.
Objetivos -Aprender la técnica de aplastado y el empleo correcto del microscopio óptico. -Identificar las etapas de la Meiosis. -Distinguir entre bivalente, cromosoma y cromátida. -Distinguir entre división Ecuacional y Reduccional. -Determinar la morfología de los cromosomas de E. plorans (acrocéntricos vs. metacéntricos). -Determinar el número cromosómico de la especie, dado que su sistema de determinación sexual es XX/X0. [-Distinguir los cromosomas B del resto de los cromosomas del complemento.]
Bandeado cromosómico
Existen numerosas técnicas de bandeado cromosómico (bandas C, G, R, T, etc.), el objetivo común de todas ellas es permitir observar un patrón que identifique inequívocamente a cada cromosoma del complemento, o bien regiones particulares de estos. Las aplicaciones de las técnicas de bandeado pueden ser muy variadas, aunque generalmente se persigue obtener (y comprender) la estructura de los cromosomas y relacionarla con su función. Las bandas también son útiles para conseguir información indirecta a partir de la identificación de las regiones los cromosomas, permitiendo detectar aberraciones cromosómicas (regiones que desaparecen, crecen o cambian de sitio: deleciones, duplicaciones, inversiones o translocaciones) o relaciones filogenéticas (por el parecido de un determinado bandeado con el de un cromosoma de otra especie, por ejemplo). Hay cuatro razones principales por las que los cromosomas muestran bandas cuando son tratados:
- Existencia de secuencias repetidas
- Diferencias en la composición de las bases
- Diferencias en la composición de las proteínas asociadas a los cromosomas
- Diferencias en el grado de empaquetamiento del ADN
El objetivo de la presente práctica es conocer la importancia de algunas de las técnicas que permiten obtener información en los genomas, particularmente observando la habilidad del bandeado para des-homogenizar la estructura de los cromosomas. Familiarizarse con los métodos de bandeado de aplicación más frecuente (G y C, RE in situ ) y sus técnicas complementarias (tinción, microscopia óptica, microscopia de fluorescencia). Comprender los fundamentos de las técnicas y la interpretación de sus resultados.
Objetivos -Obtener una imagen de una metafase en que se identifique los cromosomas humanos mediante Bandas G. Posteriormente, obtener una imagen de la misma metafase en que se identifique los cromosomas mediante Bandas C. -Obtener una imagen de cromosomas metafásicos humanos bandeados con enzimas de restricción (AluI, EcoRI o RsaI).
Cronograma
MIÉRCOLES JUEVES VIERNES
Meiosis, observación en cromosomas de Ortóptero ( E. plorans )
Bandeado G Bandeado con RE- in situ (cont.)
Selección preparaciones de mitosis ( H. sapiens ) para bandeado (x2)
Captura imágenes Bandas G Captura imágenes RE- in^ situ
Guardar preparaciones para Bandas C
Bandeado C
Bandeado con RE- in situ (inicio)
Captura imágenes Bandas C
Bandas C Preparar (para cada 4): Un coplin con HCl 0,2 N Un coplin con Ba(OH) 2 al 5 %: Disolver 3,5 g de Ba(OH) 2 en 70 ml de H 2 0d Pasar al coplin a través de un embudo de papel de filtro Mantener en el baño, 37ºC Un coplin con H 2 0d y 5 gotas de ácido acético Un coplin de 2X SSC (20X SSC, diluido en H 2 0d), mantener en baño, 65ºC
Procedimiento: Introducir la preparación en el coplin de HCl 0,2 N a RT durante 20 min Aclarar la preparación con agua corriente de grifo Pasar la preparación a la solución de Ba(OH) 2 al 5 %, a 37ºC durante 10 min Introducir la preparación en el coplin con H 2 0d y 5 gotas de ácido acético , lavar a RT durante 5 min Incubar la preparación en 2X SSC a 65ºC durante 5 min Aclarar la preparación con agua corriente de grifo (escurrir) Teñir con dos gotas distanciadas de 10 μl de Dapi 1/50 (sobre un cubre de 24 x 60 mm) y observar con microscopio de fluorescencia Capturar imagen de la/s metafase/s bandeadas, localizando con sus coordenadas
Bandeado con enzimas de restricción Seleccionar y marcar en el portaobjetos la región de interés Prepara una cámara húmeda ( válida para 4 ) Preparar ( cada uno/a ) un tubo Eppendorf con (una de estas enzimas):
Para AluI : 10 unidades de enzima AluI (mantener siempre en hielo) Tampón de la enzima 10X ( Tampón A ) (concentración final 1X) H 2 0dd hasta un volumen de 25 μl Mezclar con la micropipeta Para EcoRI : 15 unidades de enzima EcoRI (mantener siempre en hielo) Tampón de la enzima 10X ( Tampón H ) (concentración final 1X) H 2 0dd hasta un volumen de 25 μl Mezclar con la micropipeta Para RsaI : 15 unidades de enzima RsaI (mantener siempre en hielo) Tampón de la enzima 10X ( Tampón L ) (concentración final 1X) H 2 0dd hasta un volumen de 25 μl Mezclar con la micropipeta
Depositar el contenido del tubo Eppendorf que contiene la enzima y los reactivos, sobre la región a bandear de la preparación, colocar encima un cubreobjetos de 24 x 24 mm Mantener la preparación en horizontal en cámara húmeda 16 h (aprox.), en estufa a 37ºC Al día siguiente: Retirar el cubreobjetos y lavar los restos de la incubación colocando la preparación en un coplin con H 2 O destilada Incubar en 2X SSC a 37ºC durante 15 min Escurrir y secar la parte inferior del portaobjetos con papel Teñir con Tinción de Giemsa Observar con microscopio óptico (campo claro)
INFORME
Tiene que presentar una breve introducción en la que se expliquen los fundamentos de los distintos bandeados utilizados: qué detectan, cómo funcionan, por qué bandean y qué efecto tiene cada uno de los reactivos empleados. A continuación, el informe tiene que mostrar los resultados. Estos serán (al menos) tres imágenes de cromosomas humanos: con bandas G, con bandas C y con un bandeado de enzimas de restricción. Cada imagen debe llevar una leyenda explicativa completa de lo que muestra la imagen, e indicar si se identifica el cromosoma Y. No es necesario incluir ningún otro epígrafe (material y métodos, discusión…), salvo una lista de las referencias consultadas (debidamente citadas). Puede realizarse por parejas o individualmente. Tiene que entregarse impreso antes del 6 de abril de 2015 (en clase) Para consultas o tutorías, escribid a [email protected]
