Guia de miscroscopia de fluorescencia, Apuntes de Química Orgánica

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MICROSCOPÍA ÓPTICA

Generalidades

Fluorescencia

TÓPICOS EN BIOFÍSICA MOLECULAR – 1C 2022

Microscopía óptica y fluorescencia

 Conceptos básicos

 Iluminación: iluminación Köhler

 Lentes objetivo y ocular

 Óptica corregida a infinito

 Magnificación

 Apertura numérica

 Profundidad de campo

 Resolución y difracción

 Microscopía de fluorescencia

Imágenes TP laboratorios

August Köhler 1866 – 1948 Físico

Otto Schott 1851 – 1935 Químico

Ernst Karl Abbe 1840 – 1905 Físico

Carl Zeiss 1816 – 1888 Óptico

Breve historia de la microscopía

Fines del Siglo XIX (^4)

Lente : sistema óptico con dos superficies refractivas.

lentes convergentes ( positivas ) y divergentes ( negativas )

Conceptos básicos: lentes delgadas

Conceptos básicos: lentes delgadas- propiedades

 L , longitud del tubo

 el aumento lateral m 1 del objetivo

 el aumento angular M 2 del ocular

L

Conceptos básicos: microscopio- sistema de lentes

Para iluminar el objeto se pueden emplear dos mecanismos, ya sea que el

rayo de luz lo atraviese o que simplemente incida en cierto ángulo sobre el

objeto.

Conceptos básicos: iluminación

Microscopio: iluminación Köhler

 La iluminación Köhler crea un campo de visión iluminado HOMOGENEAMENTE mientras la muestra es iluminada por un cono de luz muy ancho.

 Se forman dos planos conjugados (separados) de imagen:

1. imagen de la muestra
2. imagen del filamento de la fuente de iluminación.

Planos conjugados para los rayos de la fuente de iluminación Planos conjugados para los rayos formadores de imagen^11

Tipos de objetivos. (a) Objetivo acromático que contiene una lente frontal y dos pares internos, (b) objetivo semi- apocromático o fluorita, con cuatro pares de lentes y (c) objetivo apocromático que contiene un triplete, dos pares, un menisco y una lente esférica frontal

Estructura de los objetivos

Microscopio: lente objetivo

Microscopio: lente objetivo

Lente Objetivo  colectar la luz proveniente del especimen y proyectar una imagen nítida, real, invertida y aumentada hacia el cuerpo del microscopio.

Microscopio: lente objetivo-aberraciones

Objective Type

Spherical Aberration

Chromatic Aberration

Field Curvature Achromat 1 Color 2 Colors No Plan Achromat 1 Color 2 Colors Yes Fluorite 2-3 Colors 2-3 Colors No Plan Fluorite 3-4 Colors 2-4 Colors Yes Plan Apochromat 3-4 Colors 4-5 Colors Yes

PLAN - corregidos para curvatura del campo (plan-acromáticos, plan-fluoritas o plan- apocromáticos).

 mayores distancias de trabajo

 posibilita accesorios

Microscopio: ICS, óptica corregida al infinito

Microscopio: magnificación

Los microscopios magnifican en dos pasos

AUMENTO TOTAL : Aumento del objetivo x Aumento del ocular

Considerar únicamente el aumento no es suficiente para sacar el mejor partido del microscopio, pues otro factor, la resolución , determina lo que se verá.

100 x

1- Objeto 2- Objetivo 3- Lente de tubo 4- Imagen intermedia 5- Ocular 6- Ojo^19

Criterio de Rayleigh

El límite de la distancia mínima apreciable d entre dos puntos es:

d 0 = 1.22 l 0 / NAobj + NAcond

Resolución. Es la capacidad que tiene un sistema óptico de aislar dos puntos que se encuentran muy próximos entre sí, de manera que se puedan ver individualizados uno del otro

físico inglés Lord Rayleigh (1842-1919)

Microscopio: resolución – conceptos básicos

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