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UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL
FACULTAD DE MEDICINA "HIPÓLITO UNANUE,
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS FISIOLÓGICAS
Jefe de Cátedra: Dr. Américo Leiva Rojas
PLANA DOCENTE:
- Dr. Leiva Rojas, América
- Dr. La Rosa Botonero, José Luis
- Dr. Saldarriaga Márquez, Luis
- Dra. Caballero Rupay, Gladys
- Dr. García Gutiérrez, Edwin
- Dr Díaz Tello José
- Dra. Vílchez Baquerizo, Gina
- Dr. Tineo Aliaga , Fermín
- Dr. Alcántara Díaz, Andrés Martín
- Dr. Pinto de la Sota silva Víctor
- Dra. Hernández Huerta Lady
- Dr. Félix A. Loza Mauricio
- Dr. Palomino Benavidez William
DOCENTES INVITADOS
A Evaluar durante el desarrollo de la practica
PERSONAL TÉCNICO:
- Sra. Tec. Villanueva Bias, Hilda
- Sra. Tec. Vásquez Anaya, Lucrecia
- Sr. Ramos Angula, Antonio
AÑO ACADÉMICO 2020
LIMA· PERÚ
INDICE
- l. BlOSEGURIDAD .3-
- BACTERIOLOGIA GENERAL. 6-
- lll INMUNOLOGIA 47-
- IV. BACTERJOLOGIA APLICADA 72-
- V. ATLAS DE BA CTERlOLOGIA APLICADA 114-
- VI. VIROLOGIA II8 -
- VII. INFECCIONES MlCOTICASSUPRARRENALESY PROFUNDAS 138-
- Vlll. ATLAS DE MICOLOGIA I64--
UNFV-FMHU w
Colocar las placas Petri en posición invertida para evitar que caiga el agua de condensación la cual puede estar contaminada.
Mantener los tubos en posición vertical para evitar que se mojen los tapones.
Abrir los tubos en forma adecuada, flamear la boca del tubo antes y después de efectuarse el trabajo. No dejar la tapa del tubo sobre la mesa. Las placas deben ser cubiertas cuidadosamente para evitar que se contaminen.
Esteri li zar las asas de alambre antes e inmediatamente después de usarlas. Si se ha empleado para trabajar un material que crepita como el caso del esputo, previamente al flameado introducir el asa en un frasquito de vidrio que contenga arena y alcohol. Nunca dejar las asas sobre la mesa de trabajo sino en frascos especiales y en posición vertical con el alambre hacia arriba.
Aprender a usar las pipetas adecuadamente: para el trabajo bacteriológico éstas vienen estériles y envueltas en papel. Manipularlas exclusivamente por su extremo posterior, dese nvolviéndolas en el momento de usarlas. No quitar el algodón que llevan, por ser un elemento de protección para e l que la usa. Emplear telinas para realizar la succión. No pipetear con la boca.
Eliminar pipetas, láminas y todo el material contaminado en el bocal con solución desinfectante.
En caso de accidentes como, ruptura de una placa o un tubo con material infectante, contaminación del mandil o de la mesa, etc., durante el trabajo, avisar inmediatamente al profesor.
Precauciones para realizar la Inoculación de Animales
l. Preparar el inóculo con cuidado.
- Proteger la aguja con su propio tubo antes de ha cer la inoculación, para que no se disperse el material.
- Tener cuidado de no lastimarse con la aguja.
- Eliminar inmediatamente el material de inoculación al desin fectante.
- Co lo car al animal inoculado, debidamente identificado en una jaula y ll evarlo al bioterio con sus respectivos alimentos, observar la evolución del animal y registrar los datos.
Precauciones para realizar la Autopsia de los Animales
l. Usar guantes.
- Colocar sobre la mesa papel K.raft impregnado en desinfectante.
- Hacer la menor cantidad de manipulaciones posibles, cuidando de no herirse con el material de la autopsia, e l cual debe mantenerse en todo momento dentro de un recipiente con desinfectante.
- Terminado el trabajo, envolver en el papel Kraft al animal autopsiado con todos sus detritus y entregarlo para ser incinerado.
- Colocar lo s guantes y material quirúrgico en una bandeja con desinfectante.
Guia de Prácticas de Microbiología Médica 2020 -^ 4-
UNFV- FMHU lV
Como terminar el Trabajo de Práctica
l. Todos lo s cultivos que se incuben deben tener la s siguientes anotaciones: nombres e iniciales de los
estudiantes, nombre del germen y número de mesa, sala y fecha de siembra.
En caso de las placas, todas deben ser invertidas a menos que sean dadas in strucciones contra ri as por el profesor.
- Los tubos deben estar bien tapados y colocados en canastas con gradillas de metal. 3.- Los alumnos se responsabilizarán de colocar esto s cultivos en estufas a 37 ° C.
Terminada la práctica: al finalizar el trabajo
l. Limpiar la mesa de trabajo con algodón embebido en desinfectante.
- Comprobar que las llaves del gas estén cerradas.
- Lavarse prolijamente las manos con jabón carbólico.
- El protocolo de cada práctica deberá ser controlado por el profesor al fmal de ella.
Guía de Práclicas de Microbiología Médica 2020 - 5 -
Microbiología
UNFV-FMHU
BACTERIOLOGÍA GENERAL
Es el estudio de los organismos microscópicos, deriva de 3 palabras griegas: mikros (pequeño), bios (vida) y lagos (ciencia) que conjuntame nt e significan el estudio de la vida microscópica. Los microorganismos son diminutos seres vivos que individualmente son demasiado pequeños como para verlos a simple vista. En este grupo se incluyen las bacterias, hongos (levaduras y hongos filamentosos), virus, protozoos y algas microscópicas. Normalmente tendemos a asociar estos pequeños o rga ni smos con infecciones, e nfermedades como el SIDA, o con e l deterioro de a limentos. Sin embargo, la mayoría de los microorganismos contribuyen de una forma c ru cial en el bienestar de la Tierra ayudando a mantener el equilibrio de los organismos vivos y productos químicos en nuestro medio ambiente: Los microorganismos de agua dulce y salada son la base de la cadena alimentaria en océanos, lagos y ríos; los microorganismos del suelo destruyen los productos de desecho e incorporan el gas nitrógeno del a ire en compuestos orgánicos, así como reciclan los productos químicos en el suelo, agua y ai re; c iertas bacterias y algas juegan un papel importante en la fotosíntesis, algunos animales dependen de las bacterias que habitan en sus intestinos para realizar la digestión y síntesis de algunas vitam inas como son la K y algunas del complejo B.
Primeras observaciones de los microorganismos (Leeuwenhoek y sus microscopios)
La existencia de los microorganismos no se conoció hasta la invención del microscopio. La primera persona en describir los microorganismos en detalle fue el holandés Antony Van Leeuwenhoek en 1684, a los cua le s denominó animáculos. Leeuwenhoek examinó el agua de lluvia, de mar, de rí o, sa li va y otras materias.
La fermentación como proceso biológico (Pasteur y el vino francés)
S in duda desde la Prehistoria los homb res utilizan co n provecho las fermentaciones. El pan fermentado se conoce desde hace varios miles de años. Los jeroglíficos egipcios, así como representaciones gráficas en todo el Próximo Oriente atestiguan que e l hombre recurría a la fermentación para fabricar bebidas alcohólicas ya varios mileni os antes de Jesucristo. Al preparar el pan, vino, cerveza o sake, los egipcios, sumerios y todas las personas hasta mediados del Siglo XIX, empleaban sin saberlo, y de una manera empírica, una familia de agentes biológicos muy originales: las levaduras. Son e ll as las que realizan la fermentación alcohólica.
El papel de las levaduras como agentes fermentadores no fue reconocido hasta 1856 por Lu is Pasteur. Las teorías científicas de esa época reconocían la presencia de levaduras en la fermentación a lcohólica, pero estas levaduras eran consideradas como compuestos químicos comp lejos, s in vida.
Esta era la teoría mecanística liderada por los químicos alemanes von Liebig y Wohler. Luis Pasteur, químico francés, pro puso la teoría vitalística y demostró que las células viables de levaduras causan fermentación en co ndic iones anaeróbicas; durante dicha fermentación el azúcar presente en e l mosto es convert id^ o principalmente en etanol y^ C02.^ Sus ilustraciones claramente muestran autént icas levaduras ví ni cas y en sus escritos él las diferenciaba c laramente de otros componentes.
En 18 66, Pasteur publicó la obra titulada "Estudios sobre el vino, sus enfermedades, causas que las provocan. Nuevos procedimientos para la conservación y envejecimiento". Entre las mejoras aconsejadas había un método para aumentar la calidad de la conservación de los vinos consistente en calentarlos a una temperatura de 68° C durante 1 O minutos y después enfriarlos rápidamente. Esta técnica ha venido a ser conocida como pasteurización y es ahora ampl iamente utilizada en e l tratamiento de la leche.
Guía de Prácticas de Microbiología Médica 2020 -^ 7-
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UNFV-FMHU ~
Descubrimiento de la función de los microorganismos como causantes de
enfermedades (Koch y la bacteria del carbunco)
Ya en 1546 Girolano Fracastoro había sugerido que las enfermedades podían deberse a organismos tan pequeños que no podían verse y que eran transmitidos de una persona a otra. Sin embargo, el descubrimiento de que las bacterias pueden actuar como agentes específicos de las enfermedades infecciosas en los animales fue realizado a través del estudio del carbunco, infección grave de los animales domésticos que es transmisible al hombre. La demostración concluyente de la causa bacteriana o etiología del carbunco la proporcionó en 1876 Robert Koch, un médico rural alemán. Koch empezó a estudiar el mundo microbiano después de que su mujer le regalara por su 28 cumpleaños un microscopio. Seis años después Koch anunció al mundo que había encontrado la bacteria del carbunco (Bacillus anthracis). Posteriormente él y sus colaboradores descubrieron las bacterias que causan la tuberculosis y el cólera.
Esta serie de experimentos se ajustaban a los criterios necesarios para poder establecer la relación causal entre un organismo específico y una enfermedad específica. Estos criterios se conocen como los postulados de Koch:
- El microorganismo debe estar presente en todos los casos de la enfermedad.
- El microorganismo debe ser aislado del hospedador enfermo y obtenerse en cultivo puro en el laboratorio.
- La enfermedad específica debe reproducirse cuando un cultivo puro del microorganismo se inocula a un hospedador susceptible sano.
- El microorganismo debe ser recuperable de nuevo a partir del hospedador inyectado experimentalmente.
El descubrimiento posterior de los virus (Dimitri Ivanovski en 1892; el virus del mosaico del tabaco pasaba los filtros que retenían a las bacterias), agentes que no crecen en medios artificiales en el laboratorio como lo hacen las bacterias, han permitido realizar algunas modificaciones en los postulados de Koch.
Este trabajo sobre el carbunco condujo rápidamente a la edad de oro de la bacteriología. En 25 años la mayoría de los agentes bacterianos de las principales enfermedades humanas habían sido descubiertos y descritos.
Bacterias
Las bacterias o eubacterias son microorganismos unicelulares que pertenecen al dominio Bacteria. Los miembros de este dominio tienen diferencias con aquellos pertenecientes a los otros dos dominios, Archaea y Eukarya.
En la Tierra, existen sólo dos tipos básicos de células que son estructuralmente muy diferentes: las procariontes y las eucariontes. Las bacterias son células procariontes. Estas células poseen un único cromosoma desnudo, es decir, que este cromosoma no se halla envuelto por una membrana nuclear sino que se halla en el citoplasma. Algunos investigadores se refieren a este cromosoma desnudo como nucleoide o núcleo primitivo. Otra de las características principales de las células procariontes es que no poseen organelas rodeadas por membranas como retículos endoplásmicos, mitocondrias, aparato de Golgi o lisosomas. Bacteria Archaea Eukarya
Guía de Práclicas de Microbiología Médica 2020 -^ 8-
UNFV-FMHU ~
Bacterias gram positivas de importancia en medicina
Forma de la célula Familia Género
Coco Micrococcaceae Staphy/ococcus {@)
Micrococcus {@)
Streptococcaceae Streptococcus (0)
Enterococcus (0)
Otros Peptostreptococcus (an)
Peptococcus
Aerococcus (0)
Bacilos Bacillaceae Bacil/us ($)
Clostridium (a n)
Propio ni bacteria ceae Propionibacterium (an)
Eubacterium (an)
C01ynebacterium ($)
Lactobaci llaceae Lactobacil/us (an)
Afiliación incierta Listeria
Eryspelothrix
Actinomycetaceae Actinomyces (an)
Bifidobacterium (an)
Nocardiaceae Nocardia ($)
Micobacteriaceae Micobacteria ($)
(a n) Anaerobio (®) Catalasa-positivos. (0) Catalasa-negativos. ($) Con ácidos micolicos en pared ce lul ar.
Otras bacterias de interés em medicina
Familia u orden Género
Espiroquetas Treponema
Borrelia
Leptospira
ChJamydiaceae Chlamydia
Mycoplasmataceae Afycoplasma
Ureaplasma
Rickensiaceae Rickettsia
Coxiella
Rochalimaea
Ehrlichia
Guía de Prácticas de Microbiología Médica 2020 - 1o-
UNFV-FMHU ~ , PRACTICA
1
Reconocimiento de los ambientes del laboratorio
de Microbiología y Parasitología.
- Uso del microscopio. Bioseguridad
l. USO DEL MICROSCOPIO
Objetivo: Familiarizar a l estudiante con el uso del microscopio.
t. Material
- 2 láminas portaobjetos
- 2 láminas cubreobjetos
- 1 asa de Kolle
- 1 mechero de Bunsen
- Solución sal ina
- Microscopio óptico
- Procedimiento
- Con el asa de Kolle esterilizada a la llama, tome una muestra de tártaro dentario.
- Deposite sobre una lámina portaobjeto una gota de solución salina y coloque sobre ella la muestra obtenida.
- Cubrir con una laminilla cubreobjetos.
- Observar al microscopio a menor, mediano y mayor aumento.
- Observar al microscopio de campo oscuro.
- Dibuje y anote en su cuaderno de trabajo lo observado.
11. MATERIAL QUE SE USA EN MICROBIOLOGÍA
Objetivo: Conocer el material de uso común en el laboratorio mi crobiológico.
l. Medios de Cu ltivo e Insumo Químicos:
- Frascos de medios de cultivo, específicos para diferentes organismos.
- Insumas químicos: H2S04, HCI, KOH, HCI, etc.
- Material de Vidrio, Plástico y Porcelana: Vid ri o:
- Pipetas graduadas y volumétricas
- Pipetas Pasteur
- Tubos de ensayo de diversos tamaños y marcas. Tubos de centr ifu gadora.
- Placas Petri de 9 x 12 cm. de diámetro (Pyrex)
- Campanas de Durhan para demostración de gas en cultivos líquidos.
- Frascos, matraces, Kitasatos, Erlenmeyer, viales, gotero, embudos.
- Buretas. Probetas de diferentes graduaciones. Fiolas.
- Porta objeto y cubre objetos. Porcelana:
- Morteros P lástico:
- Embudos
- Aparatos de Uso Microbiológico:
Guia de Prácticas de Microbiología Médica 2020 -^11 -
UNFV- FMHU .Jj)
Partes del Microscopio
Ocular.:s - -.
Revól ver (^) Brazo
Objetivos .... _ Dcsplan unic nt o platina
Platina
rv1acrométrico
Ha se ·
Morfología esquemática de las bacterias
Cocos o^ ,SP
oo § CD
,.._
o o^ >< ,.,. o (^) JJ
...."~-b
A1slados (^) PareJas Cadenas
Bacilos
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Rac1mos Te tradas
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##### [/ _1_ _1_ ##### IJ Co cobac,l os Extremos Extremos Extremos Fus,lormes Empa liz adas Est rept obac tlos Espi nlo V1b nones en maz a redon dos cuad rados Helicoidales _Borreha Trepon ema Leptosptra_ #### Guía de Prácticas de Microbiología Médica 2020 -^ 13- UNFV- FMHU 'WJ ### MATERIAL BÁSICO DE LABORATORIO -·-_> -- _)_ ~~ Ptcri _r_ .. ....,..¡., **Oodlttf'r** Ma~~n ,; Kit:»ate = _"'... .r_ Gradilla y •~IH» d~ ~~U-·~" ¡¡ _)_ ~.-~~~ Vldrln dr n ·I•J 1 f'6 ¡uula dr putrrlaaa #### Guía de Prácticas de Microbiología Médica 2020 8unu _1_ f. ~ t ;'il _1_ ,, ,JI **\'uo d.t prwipibdot** ) a;:it.ader lbm **UNFV-FMHU** ~ - 1 Asa de Kolle 2. Procedimiento: - Aislamiento por método de sembrado de estrías. a) Estría Simple b) Estría por Agotamiento - Siguiendo estrictamente las reglas de asepsia aprendidas en experimento 1, con el asa de Kolle, tome una muestra del tubo con caldo de cultivo miA10 y dibuje, estrías sobre la superficie del medio de cultivo en la placa Petri estéril con agar nutritivo, como en el esquema. Esquemas: Estría Simple Estría por Agotamiento - Marque la placa con lápiz de vidrio y lleve a la estufa a 37°C por 24 h. - Tome la placa Petri no estéril y márquela en su parte posterior colocando ··No estéril", llévela a la estufa a 37 °C por 24h. - Tome los dos tubos de caldo nutritivo y con la pipeta estéril transfiera 1 mi de caldo de un tubo a otro y viceversa por 5 veces, usando la misma pipeta, tapone los tubos y llévelos a la estufa a 37°C por 24 a 48 h. #### III. EXPERIMENTO N° 3: Cultivo de Organismos Anaerobios. J. Material: - 2 Tubos con Agar Nutritivos vertical - 2 Tubos con Agar Nutritivos inclinado - 2 Tubos con Caldo de Tioglkolato o caldo carne - Campaña de Durham o Jarra Gaspack - Cepas de Clostridium sporógenos y Bacillus subtilis 2. Procedimiento: - Siembre cada cepa en uno de cada par de tubos, por puntura en el agar vertical. por estría en el inclinado y asada en el caldo. Tapone los tubos y lleve a la Campaña de Durham. Incube a 37°C por 24 h. #### lV. CUESTIONARIO 1.- Interprete los resultados obtenidos en cada uno de los medios de cultivo utilizados. #### Guía de Prácticas de Microbiología Médica 2020 -^ 16- **UNFV- FMHU** ¡y ##### Inoculación de placas de cultivo para el ##### aislamiento de colonias bacterianas ##### Técnica de inoculación de medios para recuentos semicuanlilativos de colonias bacterianas. (^2 ) lno("ulac•ón prirnana (^) (\Iría f"n angulo recto (^) f \trfa en ángulo recto pdra produ<~r una _"e.te•a" de_ de<arrollo In oculació n de un tubo con ca ld o. A. Inclinar el tubo e inocular en el sitio indicado. De este modo el sitio de inoculación queda sumerg id o bajo la superficie. Punto de inoculac•ón ## ........____.. ### B La in oc ul ación de un pico de agar se rea li za mediante un alambre recto. A. Atravesar con el alambre el agar en profundidad. B. Retirar el alam bre y estriar la superficie del agar con un movimiento en S. #### Guía de Prácticas de Microbiología Médica 2020 -^ 17- **UNFV-FMHU** ~ #### Clasificación de los Medios de Cultivo l. Según su estado físico - Líquidos: Llamado ca ld o, libre de agar que contiene productos orgánicos. - Sólidos: Derivan de los líquidos, añadiendo un coloide en estado de gel y este le da la sol id ez. Es usado en Placa Petri. - Semisólidos: Contiene menos del 1% del agar. 2. Según su composición - Empíricos: Son aquellos preparados a partir de sustancias naturales, cuya naturaleza química se desconoce. - Sintéticos: Sus preparados son disoluciones de diversas sustancias químicas conocidas. - Semisintéticas: Es una mezcla de los anteriores. 3. Por su composición - Comunes: Su finalidad es el crecimiento de microorganismos poco exigentes. Ejm: Caldo común, agar simple. - Enriquecidos: Son los medi os comunes a los que añade un suplemento nutritivo, para el crecimiento y desarrollo de bacterias exigentes. Ejm: Agar sangre, agar pata g lu cosa. - Selectivos: Permiten se leccionar un tipo y este se consigue a lt erando las condiciones fisicas y químicas del medio. Pueden ser: o Por cambio de ph. Favorece a los lactobac illus. o Por cam bi os de temperatura. Favorece S. Faeca li s. o Por altas [] osmót icas. Como e l staphylococu s. o Con antisépticos. Ejm: el medio Sa lm o nella- Shigella. - Con antibióticos. Ejm: Candida albicans. - Diferenciales: Permiten distinguir a simple vista dos o mas tipos de bacteria en función a su comportamie nt^ o sobre .el medio. A su vez pueden^ se^ r simples o combinados. - De transporte: Utilizado para asegurar la viabi lidad de las bacterias desde el momento de la toma hasta su siembra en e l laboratorio. Ejm. E l medio de transporte de Amies. #### Medio de Cultivo Un medio de cultivo es una solució n acuosa (como tal o in corporado a un gel) en la que están incorporados todas las sustancias necesarias para el crecimiento y multiplicación de microorganismos en el laborato ri o, con el objeto de aislar las diferentes especies bacterianas u hongos, para luego proceder a su identificación y llevar a cabo una serie de estudios complementarios. #### Siembra, aislamiento y transplante de bacterias - Siembra es e l procedimiento por el cual se acondiciona al microorganismo a un medio de cultivo férti l para que este pueda desarrollarse. - Aislamiento es la técnica que separa microorganismos al estado de pureza y para ello se requiere un medio sólido. - Transplante significa la separación de la cepa a un medio de cultivo apropiado en tubo, lográndose conocer las propiedades bioquímicas y su id entificación. #### Guía de Práclicas de Microbiología Médica 2020 -^ 19- --l **UNFV- FMHU** **_$1_** id , **PRACTICA** - **Metabolismo Bacteriano. *Enzimas de los** **microorganismos. *Fermentación bacteriana.** ### l. EXPERIMENTO N° 1: Hidrólisis de l Almidón **3** Objetivo: Hacer conocer al alumno que existen microorganismos que producen exoenzimas y que atacan substratos importantes como Carbohidratos y Proteínas. El almidón es un polímero de glucosa, se encuentra como material de reserva. Es hidrolizado por las enzimas: Alfa Amilasa y Beta Amilasa. También puede ser hidrolizado por los Acidos Minerales. ALFA AMlLASA + ALMIDON =DEXTRINA+ ALFA MALTOSA BETA AM ILASA + ALM IDO N =ALFA MALTOSA Las Amilasas son enzimas extracelulares l. Materiales: - Solución de Yodo (Lugol) - Cepas de Baci ll us subtilis y Escherichia coli. - 1 Placa de Agar Almidón 2. Procedimiento: - Dividir en dos sectores la placa de Agar almidón - Inocular en estrías cada sector con las capas de B. subtilis y E. co li. - Incubarlo a 37°C por 24 h. Se comprueba la Hidrólisis añadiendo unas gotas de Lugol. La ausencia de color azul indica Hidrólisis total del Almidón. El color pardo puede indicar Hidrólisis Parcial del Almidón. Nota: Este experimento también se puede realizar el tubo de Agar-Almidón. ### 11. EXPERIMENTO N° 2: Hidrólisis de la Gelatina La gelatina es una proteína dotada de la propiedad de tomar GEL cuando se disuelve en agua caliente Por tratarse de una proteína puede ser atacada por alguna bacterias que la priven de su propiedad gelitificante. La hidrólisis de la gelatina es una reacción enzimática y se conoce por GELATrNASA la enzima causante de esta transformación. l. Materia les: - Cepas de S. Aureus, B. subtilis y E. coli. - Tres tubos de Gelatina Nutriente estéril - Asa de Kolle en aguja #### Guia de Prácticas de Microbiología Médica 2020 -^ 20-
