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Asignatura: fv, Profesor: Ildefonso Bonilla, Carrera: Biología, Universidad: UAM
Tipo: Ejercicios
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Comisión Docente de Fisiología Vegetal
Departamento de Biología
Universidad Autónoma de Madrid
Cantoblanco 28049 Madrid
ORGANIZACIÓN DE LAS SESIONES PRÁCTICAS
Lunes 1 Determinación^ de potencial osmótico^ en^ tejido^ epidérmico de cebolla y de potencial hídrico en tubérculo de patata Martes 2 Caracterización^ de pigmentos^ fotosintéticos^ en hoja de espinaca y cianobacterias Miércoles 3 Medida del flujo fotosintético de electrones no cíclico en extractos de hoja de espinaca Jueves (^4)
Preparación 5
Determinación “in vivo” de actividad nitrato reductasa en hojas de maíz Preparación de tratamientos de semillas de cebada (para capacidad germinativa y ά-amilasa) Viernes 5 Estimación de la capacidad germinativa de semillas de cebada Determinación de actividad de -amilasa en semillas de cebada Presentación Resultados
Archivo Excel Presentación y análisis de los resultados obtenidos
PROFESORES DE PRÁCTICAS DE FISIOLOGÍA VEGETAL
Grupos 1314, 1315 y 1316: Eduardo Fernández-Valiente [email protected] Eduardo Marco [email protected] Flor Martínez [email protected] Eva Sánchez-Maeso [email protected]
Grupos 1324, 1325 y 1326 Ildefonso Bonilla [email protected] Eduardo Marco [email protected]
Grupos 1364, 1365 y 1366 Ildefonso Bonilla [email protected] Eduardo Fernández-Valiente [email protected] Luis Eduardo Hernández [email protected] Javier Lloret [email protected] Miguel Redondo [email protected] Eva Sánchez-Maeso [email protected]
Grupos 1374, 1375 y 1376 Eduardo Fernández-Valiente [email protected] Luis Eduardo Hernández [email protected] Javier Lloret [email protected] Cristina Ortega [email protected] Eva Sánchez-Maeso [email protected]
Profesores de apoyo que colaboran en la docencia: Cristina Casero Jara Hurtado Candela Muriel
P PRREEÁÁMMBBUULLOO
El desarrollo de estas sesiones prácticas de laboratorio se ha ideado como complemento a la parte teórica de la asignatura. Se pretende mostrar con experimentos sencillos que los conceptos teóricos se basan en observaciones experimentales.
En Fisiología Vegetal se emplean técnicas experimentales también utilizadas en otras ramas del conocimiento científico, algunas de ellas complejas. Para poder sacar conclusiones de los datos obtenidos, y así poder interpretar lo que está sucediendo en la planta en un momento dado, se ha de poseer un conocimiento básico amplio. Conceptos de química, física y matemáticas son necesarios para dicha interpretación. Resulta interesante por ello resolver, desde el principio, las dudas que puedan surgir consultando libros, apuntes y otras fuentes de información. Por supuesto, los profesores ayudaremos también gustosamente a aclarar esas dudas, pero buena parte de su comprensión radica en el esfuerzo e interés del alumno.
Para aprovechar al máximo estas prácticas es necesario que el alumno se enfrente a sus dudas con suficiente antelación. De este modo, cuando el profesor explique el desarrollo de los experimentos y de los cálculos posteriores, se podrán solventar todos los puntos no suficientemente aclarados. Una actitud participativa del alumno es, por tanto, muy positiva para el correcto desarrollo de la asignatura. Además, esa actitud redunda en una mayor motivación de los profesores, que hemos de realizar una importante inversión de tiempo y energía tanto en la preparación material y de contenidos de las sesiones prácticas, como en el análisis posterior de los resultados obtenidos.
Hay una serie de conceptos esenciales que conviene tener asentados. Sabiendo responder a las siguientes preguntas se tendrá bastante ganado para la comprensión de las prácticas:
tiene una recta de calibrado?
misma concentración?
misma disolución?
nueva concentración?, y ¿si la diluimos tan sólo dos veces?
preparado de la siguiente manera: tomamos 0.5 mL de sacarosa 10 M y le añadimos 1.5 mL de H 2 O.
Es altamente recomendable realizar un Cuaderno de Practicas Personal en el que se lleve un registro puntual del desarrollo de los experimentos llevados a cabo, así como de los resultados obtenidos y su análisis posterior, tanto de los datos propios como del resto de equipos del grupo. Un cuaderno bien hecho es el mejor material de partida para la preparación del examen de Prácticas.
Destacar finalmente que la limpieza, el trabajo metódico y el orden son aspectos esenciales que deben acompañar siempre al trabajo experimental, así como atender las normativas de seguridad e higiene en el trabajo y de gestión de residuos.
P PRRÁÁCCTTIICCAA (^11)
Introducción
El potencial hídrico, concepto ampliamente utilizado en Fisiología Vegetal para entender las relaciones hídricas de las plantas, es una forma de medida de la energía libre del agua por unidad de volumen, que suele referirse en unidades de presión. El agua se mueve desde el suelo al aire a través de la planta en tres etapas: del suelo a la planta, dentro de la planta y de la planta al aire. El agua SIEMPRE se desplaza debido a la diferencia de potencial hídrico ( ).
En el material vegetal, el potencial hídrico es el resultado de la suma de una serie de componentes: potencial de presión, potencial osmótico, potencial matricial y potencial gravitacional.
= p + л + m + g
Ahora bien, a la hora de determinar el potencial hídrico en el caso de células vegetales adultas que se estudian en el laboratorio, los componentes de potencial matricial ( m) y potencial gravitacional ( g) se pueden despreciar por su escaso o nulo valor en comparación con los otros componentes, y así el potencial hídrico será el resultado de la suma de dos únicos componentes: el potencial de presión ( p )
= p + л
En las células, el p representa la presión que ejerce el citosol sobre la pared celular y recibe varios nombres, entre ellos presión de turgencia , siendo su valor siempre 0.
El está relacionado con la presión osmótica (), siendo su valor el de la cambiado de signo: la tiene valores 0, y por tanto el 0.
También es posible conocer el valor de potencial hídrico de una solución acuosa. Al trabajar en el laboratorio a presión atmosférica, el valor de potencial de presión de las soluciones que preparamos es siempre cero, y por ello el valor del potencial hídrico de una solución es igual al valor de su potencial osmótico.
= л
La aproximación a la ecuación de Van`t Hoff permite determinar el potencial osmótico de cualquier solución acuosa de concentración conocida (y por tanto, su potencial hídrico).
л = - R T i Cs
Donde: R = constante universal de los gases (R = 8.314 J K-1^ mol-1) T = temperatura en grados Kelvin (si el laboratorio está a 22 oC esto supone 295 K) i = coeficiente de disociación del soluto (número de compuestos iónicos distintos que se forman, -en compuestos no disociables i=1) Cs = concentración de la solución en moles de soluto por litro de disolvente
El л tiene siempre un valor negativo y se suele expresar en megapascales (1 MPa = 1 x 10^6 Pa, sabiendo que 1 Pa = 1 J m-^3 ; también 1MPa = 10 bar)
Metodología
1- Calcular y pesar la sacarosa necesaria para preparar, utilizando agua destilada, soluciones de sacarosa de la siguiente concentración: 1, 0.7, 0.6, 0.45, 0.3 y 0.2 moles de sacarosa/ litro de agua. En principio, partir de 600 mL de agua destilada para hacer cada solución. Disolver completamente la sacarosa utilizando un agitador magnético con la ayuda de un imán.
2- Preparar 6 tubos de ensayo y añadir a cada uno 5 mL de una de las soluciones de sacarosa de concentración conocida.
3- Con ayuda de pinzas y tijeras, evitando tocar con los dedos, obtener 6 fragmentos similares de una misma capa de epidermis interna de bulbo de cebolla (una fina lámina translúcida que se desprende fácilmente de la parte cóncava de cada una de las capas del bulbo de cebolla) e introducir inmediatamente cada fragmento en una de las soluciones. Los fragmentos no deben flotar, sino que tienen que quedar totalmente embebidos en las soluciones. Dejar transcurrir al menos treinta minutos para que, si existen diferencias entre el de la solución y el de las células vegetales, se produzca el equilibrio hídrico correspondiente.
4- Sacar cada muestra y montarla en un portaobjetos en el que previamente se ha depositado una gota de la misma solución. Tapar con un cubreobjetos y observar al microscopio. Identificar el aspecto que presentan las células turgentes y las células en plasmolisis utilizando las muestras adecuadas (que serán las sometidas a la solución más concentrada y la más diluida).
5- Para cada muestra, contar con paciencia como mínimo 100 células tomando al azar distintos campos visuales e identificar el número de células que aparecen plasmolizadas y sin plasmolizar en cada caso. Determinar con esos datos el % de plasmolisis de cada muestra. Es importante no montar todas las preparaciones al mismo tiempo, puesto que en este caso se irá evaporando el agua y por tanto variará la concentración de soluto antes de realizar las observaciones al microscopio.
6- Para terminar, tomar la muestra de tejido en que la plasmolisis sea más acusada e introducir en un tubo de ensayo con 5 mL de agua destilada. Observar la muestra al microscopio unos 30 minutos después. ¿Se ha producido alguna variación?
7- Representar gráficamente en papel milimetrado el porcentaje de plasmolisis de cada muestra frente al potencial osmótico en MPa de la disolución en la que se encontraba (que habrá que determinar utilizando la aproximación de Van`t Hoff). Los puntos experimentales obtenidos seguramente se ajustarán a una curva sigmoidal, con una zona de variación lineal. Determinar por interpolación gráfica en esa zona de variación lineal el potencial osmótico correspondiente al 50% de plasmolisis. De esta manera conoceremos el potencial osmótico medio del tejido de epidermis de cebolla.
Cuestiones:
-------------------------------------------------------------------------------------------
Potencial osmótico
% células plasmolizadas
7- Calcular la ganancia o pérdida de peso en cada caso (es decir, peso final de cada par de rodajas menos su peso inicial) y establecer el % de ganancia o pérdida de peso (respecto al peso inicial) que se ha producido con cada una de las distintas soluciones.
8- Calcular el potencial hídrico de cada solución de sacarosa y representar en una gráfica los valores experimentales obtenidos de % de ganancia o pérdida de peso frente al potencial hídrico de las soluciones. Debería observarse una relación lineal. Trazar la recta que mejor se aproxime a los puntos experimentales y determinar el potencial hídrico del tejido, que coincidirá con el del potencial hídrico de una solución de sacarosa que no produce ni aumento ni disminución de peso del tejido vegetal.
Cuestiones:
RESUMEN de procedimiento PRÁCTICA 1
Preparar, utilizando siempre un volumen inicial de agua destilada de 600 mL las siguientes soluciones de sacarosa: 1, 0.7, 0.6, 0.45, 0.3 y 0.2 moles de sacarosa/litro de agua
EPIDERMIS DE CEBOLLA
Metodología 1- Preparación de extractos Plantas: Se trocean 2 g de hojas de espinaca sin peciolo y se trituran en un mortero hasta conseguir una pasta homogénea. Se añaden 8 mL de etanol y se mezcla todo bien con la mano del mortero. A continuación, el triturado obtenido se filtra, primero a través de una gasa doble colocada sobre un embudo de vidrio y, después, a través de papel de filtro también sobre un embudo, para separar los restos de tejido. De esta manera, el líquido resultante consiste ahora en un extracto etanólico crudo que contiene los pigmentos vegetales ( Solución 1 ). Conservar 1 mL del extracto en un tubo eppendorf en oscuridad. Parte de este extracto se utilizará para realizar una cromatografía en capa fina y otra parte para hacer un espectro de absorción.
Cianobacterias: Para realizar los espectros de absorción in vivo se toman 3 mL del cultivo de Anabaena en un tubo de ensayo, se transfieren posteriormente a la cubeta del espectrofotómetro y se hace un espectro de absorción que abarque el rango de la luz visible (350 a 750 nm) frente a un blanco de agua.
Para extraer los pigmentos polares (ficobiliproteínas), que son hidrosolubles, centrifugar 3 mL del cultivo de Anabaena en dos tubos eppendorf durante 10 min a 13400 rpm. Los tubos eppendorf, con un peso similar, deben quedar enfrentados en el rotor de la centrífuga (equilibrado del rotor). Descartar el sobrenadante (con cuidado ya que se resuspende con facilidad) y resuspender las células de cada tubo en 650 l de agua destilada. Juntar las dos suspensiones en un tubo de vidrio, añadir 50 l de tolueno y agitar vigorosamente durante al menos 30 segundos en un agitador Vortex. Transferir a un tubo eppendorf, dejar reposar un tiempo mínimo de 30 min en oscuridad y finalmente volver a centrifugar a 13400 rpm durante 10 min para eliminar los restos celulares (recordad que el rotor siempre debe quedar equilibrado). Finalmente, transferir el sobrenadante, de color azul, a un nuevo tubo eppendorf para analizarlo espectrofotométricamente ( Solución 2 ).
2- Cromatografía en capa fina Una cromatografía es un método que permite separar los distintos componentes de una mezcla compleja mediante técnicas basadas en el principio de retención selectiva. Todas las técnicas cromatográficas se basan en la existencia de una fase móvil que consiste en un fluido que arrastra a la muestra a través de una fase estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido (soporte). En nuestro caso, la fase móvil es líquida y está constituida por una mezcla de disolventes apolares (eluyente) y la fase estacionaria consiste en un sólido, una capa fina de gel de sílice de naturaleza polar, depositada sobre una placa de material plástico, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los más apolares.
Utilizar el extracto inicial de hojas de espinaca ( Sol. 1 ). Este extracto etanólico crudo constituye una mezcla compleja de pigmentos, principalmente clorofilas, carotenos y xantofilas, que pueden separarse por cromatografía en capa fina. Para ello se utilizará como soporte un gel de sílice. Aplicar el extracto, con ayuda de un capilar de vidrio, trazando (de forma repetida) una línea recta a 2 cm del borde inferior formando hasta conseguir una banda de color intenso pero estrecha. Introducir a continuación la placa de gel de sílice verticalmente en una cubeta de cromatografía a la que inmediatamente antes se ha añadido el eluyente o fase móvil (éter de petróleo: isopropanol: agua, en proporción 100 mL : 11 mL : 5 gotas) y cerrar rápida y herméticamente para que no se evapore el eluyente. En contacto con el gel de sílice, el eluyente irá ascendiendo por capilaridad arrastrando con distinta afinidad los pigmentos depositados. Dejar transcurrir el tiempo necesario para que proceda la separación de los diferentes pigmentos hasta que el pigmento que avanza más rápidamente se sitúa próximo al frente (línea superior que ha alcanzado el eluyente). Sacar entonces la placa y medir la distancia recorrida por el eluyente y la distancia recorrida por cada una de las bandas de pigmento desde el origen de aplicación. Así puede calcularse el Rf, o factor de retención o frente relativo (Rf = distancia de una banda/ distancia del frente) para cada pigmento. Comparar las diferentes bandas de pigmentos que aparecen en las cromatografías realizadas.
3- Espectros de absorción y determinación de concentración de clorofila a 3.1- Espectro de absorción del extracto etanólico crudo de espinaca (Solución 1) y a bsorbancia a 665 nm. Normalmente, el extracto está muy concentrado y se sale del rango de medida del espectrofotómetro. Por ello, es conveniente diluir antes de hacer el espectro de absorción: tomar 0,1 mL de Sol. 1 y añadir 4.9 mL de etanol (dilución 1/50). Mezclar bien y realizar un espectro de absorción que cubra todo el rango de luz visible (350 nm a 750 nm). Utilizar etanol como “blanco” de referencia. Anotar los máximos de absorción y especialmente el valor de la absorbancia a 665 nm, que permitirá calcular la concentración de clorofila a en el extracto aplicando la Ley de Beer-Lambert:
Absorbancia= ε x [c] x L ε = coeficiente de extinción (mL mg-1^ cm-1) [c] = concentración (mg x mL-1) L= espesor de la muestra (1 cm, que es el grosor de la cubeta del espectrofotómetro)
(El coeficiente de extinción ε, para clorofila a disuelta en etanol a 665 nm es 76,07 mL mg-1^ cm-1)
3.2- Espectro de absorción de la fracción de ficobiliproteínas de Anabaena (Solución 2). Realizar el espectro de absorción (de 350 a 750 nm) utilizando en este caso agua como “blanco” de referencia y anotar los máximos de absorción.
3.3- Espectros de absorción de los pigmentos separados. La cromatografía en capa fina ha permitido la separación y por tanto purificación de pigmentos de la hoja de espinaca. Ahora se pueden recuperar de forma independiente rascando cada una de las bandas coloreadas obtenidas (que corresponderá a un pigmento) con un bisturí sobre papel inerte. Introducir con cuidado el polvo obtenido en cada caso en un tubo eppendorf, añadir 1 mL de etanol y agitar. De esta manera el pigmento obtenido en cada caso vuelve a disolverse en etanol. Centrifugar los tubos durante 3 min a 13400 rpm en una centrífuga eppendorf para que sedimenten las partículas de sílice, y recuperar cada sobrenadante en un nuevo tubo eppendorf. Finalmente, hacer el espectro de absorción (de 350 a 750 nm) de cada sobrenadante (pigmentos aislados) en el espectrofotómetro utilizando etanol como “blanco” de referencia. Anotar los máximos de absorción, que permitirán la identificación de cada pigmento.
Orden a seguir 1- Obtención del extracto etanólico de espinaca (Sol.1) 2- Cargar las cromatografías de espinaca e inicio de la cromatografía 3- Hacer espectro de absorción in vivo de Anabaena 4- Inicio de la obtención del extracto de ficobiliproteinas de Anabaena (Sol. 2) 5- Espectro de absorción de la Solución 1 y determinación clorofila a
Estructura de la clorofila a y su relación con la clorofila b. El anillo tetrapirrol de la parte superior da el color verde (*pirrol) mientras que la cola fitol C 20 H 39 , común a ambas clorofilas, probablemente penetra la membrana. La clorofila a es verde-azul; la clorofila b es verde-amarilla
Estructura de algunos Carotenos y Xantofilas. Todos ellos son tetraterpenos (C 40 ) formados por la condensación, cola con cola, de dos unidades de 20 C, a su vez formadas por la condensación, cabeza con cola, de cuatro unidades de isopreno. Los carotenoides presentan colores que varían entre el amarillo, naranja o el rojo.
Estructura de dos ficobilinas : Ficocianobilina y Ficoeritrobilina. Las ficobilinas se ligan covalentemente a proteínas formando ficobiliproteínas (ficocianina y ficoeritrina respectivamente) y confieren un color azulado o rojizo
RESUMEN de procedimiento PRÁCTICA 2 Y ORDEN A SEGUIR
1- Obtención del extracto etanólico de espinaca (Sol. 1) Trocear 2 g de hojas de espinaca y triturar en mortero hasta obtener una pasta Añadir 8 ml de etanol y mezclar Filtrar el triturado a través de una gasa doble en un embudo y luego a través de papel de filtro Recoger 1 mL de la solución en un tubo eppendorf y conservar el extracto en oscuridad 2- Cargar las cromatografías de espinaca Con un capilar de vidrio, aplicar el extracto a 2 cm del borde de la placa trazando una línea recta Introducir la placa en la cubeta de cromatografía conteniendo 100 mL de eluyente y cerrar herméticamente 3- Hacer un espectro de absorción in vivo de Anabaena Coger 3 mL de cultivo en un tubo de ensayo. Introducirlos en la cubeta del espectrofotómetro Realizar un espectro de absorción en el rango de la luz visible (350-750 nm) 4- Inicio de la obtención del extracto de ficobiliproteínas de Anabaena (Sol. 2 ) Centrifugar 3 mL de cultivo (en 2 tubos eppendorf) durante 10 min a 13400 rpm (deben quedar enfrentados en el rotor) Descartar el sobrenadante y resuspender las células en 650 μL de agua destilada Juntar el contenido de los dos tubos en un tubo de vidrio corto Añadir 50 μL de tolueno y agitar durante 30 segundos en un agitador Vortex Transferir a un tubo eppendorf y dejar reposar en oscuridad un tiempo mínimo de 30 min 5- Espectro de absorción de la Sol. 1 y determinación de clorofila a Hacer una dilución 1/50 de la Sol. 1 (coger 0.1 mL de Sol. 1 y añadir 4.9 mL de etanol) Introducir en la cubeta del espectrofotómetro y realizar un espectro de absorción en el rango de la luz visible Anotar la absorbancia a 665 nm, que permitirá calcular la concentración de clorofila a 6- Recogida de la cromatografía de espinaca y obtención de los espectros de absorción de los pigmentos Comprobar que se ha resuelto la cromatografía (deben aparecer las bandas separadas de los distintos pigmentos) Sacar la placa de la cubeta y rápidamente medir la distancia recorrida por el eluyente y cada pigmento (estos datos permitirán calcular los Rfs de los pigmentos) Rascar cada banda de la cromatografía con un bisturí sobre papel inerte Introducir el polvo en un tubo eppendorf, añadir 1mL de etanol y agitar Centrifugar durante 3 min a 13400 rpm y recuperar el sobrenadante en un nuevo tubo eppendorf Hacer el espectro de absorción de cada sobrenadante anotando los máximos de absorción obtenidos; identificar los pigmentos 7- Finalización de la obtención del extracto de ficobiliproteínas de Anabaena (Sol. 2 ) Centrifugar las muestras que han estado en oscuridad durante 10 min a 13400 rpm Recuperar el sobrenadante y realizar con él un espectro de absorción anotando los máximos de absorción obtenidos; identificar 8- Análisis global de los resultados obtenidos
NOTAS: Las hojas de espinaca deben ser frescas o de bolsa recién abierta El DCMU se prepara a una concentración 10-4^ M pero luego se diluye para utilizarlo a una concentración 10-5^ M El ferricianuro potásico 15 mM debe prepararse fresco para cada sesión y mantenerse en oscuridad
Metodología ES MUY IMPORTANTE REALIZAR TODO EL PROCESO EN FRÍO (UTILIZANDO HIELO PICADO EN UN VASO DE PRECIPITADOS) Y EN CONDICIONES DE PENUMBRA O LUZ TENUE.
A) OBTENCIÓN DE TILACOIDES
-Se pesan 5 g de hojas de espinaca, se elimina el nervio central, se trocean con unas tijeras y se trituran en seco en un mortero hasta conseguir una pasta homogénea.
-Se suspende el material celular en 20 ml de una solución fría de NaCl al 2%. En esta solución los cloroplastos, una vez fuera de las células debido a la abrasión, se mantienen sin romperse.
-Para eliminar restos de hoja, el homogeneizado obtenido, de color verde intenso, se filtra a través de un embudo con una gasa doble, repartiendo el contenido en dos tubos de centrifuga (no más de 8 mL en cada uno). A continuación, utilizando una balanza de platillos, transferir entre ellos el volumen de solución necesario hasta que los dos tubos de centrífuga pesen exactamente lo mismo ( SIEMPRE hay que equilibrar el peso de los tubos antes de introducirlos enfrentados en el rotor de la centrífuga). Hecho esto, centrifugar a 1000 rpm durante 3 min a 4 oC en una centrífuga refrigerada.
-El sobrenadante obtenido contiene los cloroplastos aislados de la hoja de espinaca (se puede comprobar por observación de una gota a través del microscopio), mientras que en el sedimento quedan los últimos restos de las hojas.
-Se recoge con cuidado el sobrenadante en dos nuevos tubos de centrífuga, se equilibra el peso y se centrifuga de nuevo a 4000 rpm durante 10 min a 4 oC, tras lo cual, se obtiene un sedimento que contiene la mayoría de cloroplastos del extracto.
-Tras eliminar el sobrenadante, los cloroplastos, que están en el sedimento, se resuspenden cuidadosamente (con una torunda de algodón) en 5 mL de NaCl al 0.2% frío (es decir, hay que añadir 2, mL a cada tubo). De esta manera, los orgánulos se rompen y quedan los tilacoides en suspensión.
-Finalmente se reúne toda la suspensión en un único tubo. Esta es la suspensión de tilacoides con la que haremos el ensayo de actividad fotosintética, que debe mantenerse en frío y en oscuridad hasta el momento de su utilización.
-Para valorar la concentración de clorofila en la suspensión de tilacoides, se coge 0,1 mL de la suspensión de tilacoides en un tubo de ensayo y se añade 9,9 mL de etanol
-Se agita bien y se filtra a través de un embudo con un papel de filtro.
-Calcular la concentración de clorofila en la suspensión de tilacoides teniendo en cuenta la ecuación de Beer-Lambert, la dilución realizada y el coeficiente de extinción de la clorofila a 665 nm, que es 76, mL mg-1^ cm-1.
Para determinar la actividad del FS II en base a la reducción del ferricianuro potásico: -Se prepara una serie de ocho tubos (según tabla adjunta), utilizando tubos de centrifuga):
Un tubo (1) “blanco” que servirá para calibrar a “cero” la absorbancia en el espectrofotómetro Dos tubos control (2 y 3) que servirán para valorar si se produce una reducción espontánea de ferricianuro a lo largo del tiempo en ausencia de tilacoides Cuatro tubos de reacción (4, 5, 6, y 7) que servirán para valorar la reducción de ferricianuro debida a la actividad de los tilacoides a distintos tiempos de reacción Y un tubo (8) con inhibidor del FSII, DCMU que permitirá observar el efecto del inhibidor sobre el transporte electrónico. Debe seguirse el siguiente orden :
Blanco Contr t0 Contr t15 Reacc t0 Reacc t5 Reacc t10 Reacc t15 Inhibidor
Tubos (numeración) 1 2 3 4 5 6 7 8 Tampón Tris (mL) 2.5 2.6 2.6 2.1 2.1 2.1 2.1 2
Ferricianuro (mL) - 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.
DCMU (mL) - - - - - - - 0.
Tilacoides* (mL) 0.5 - - 0.5 0.5 0.5 0.5 0.
TCA** (mL) 0. a t 0
a t 0
a t15 min
a t 0
a t5 min
a t10 min
a t15 min
a t15 min
