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Asignatura: salud publica, Profesor: salud publica, Carrera: Enfermería, Universidad: UPV-EHU
Tipo: Apuntes
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I
ISBN: 84-609-2289-
II
**1. Introducción
En el año 1993 se publicó el número 3 de los Procedimientos en Microbiología Clínica titulado Hemocultivos. Desde entonces se han producido importantes cambios en la incidencia y en la etiología de la bacteriemia y la fungemia, así como en los métodos para detectarlas, por lo que la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica ha considerado imprescindible revisar y poner al día este procedimiento teniendo en cuenta todos estos aspectos. Este documento se estructura en dos apartados: el primero constituye una guía práctica de recomendaciones para los microbiólogos clínicos basada en la información publicada y el segundo se justifica por la necesidad de disponer de protocolos de trabajo normalizados (PNT) para la certificación de los laboratorios según las normas ISO, pudiendo posteriormente ser adaptado a las particularidades de cada laboratorio.
2. BACTERIEMIA La detección de la bacteriemia y la fungemia constituye una de las prioridades del Servicio de Microbiología Clínica, dada su importancia diagnóstica y pronóstica ya que se asocia con una elevada mortalidad que oscila entre el 20 y el 50%. Se define como bacteriemia la presencia de bacterias en la sangre que se pone de manifiesto por el aislamiento de éstas en los hemocultivos. El término fungemia se utiliza para designar la presencia de hongos en la sangre. Septicemia y sepsis son expresiones que se emplean para denominar el síndrome clínico con el que habitualmente se manifiestan las bacteriemias o las fungemias, independientemente del resultado de los hemocultivos, por lo que en numerosas ocasiones resultan confusas y no se utilizarán en este documento. La bacteriemia y la fungemia son complicaciones graves de las infecciones bacterianas y fúngicas, respectivamente, y tienen una metodología diagnóstica muy similar por lo que se describirán de forma conjunta. Ambas se producen cuando los microorganismos invaden el torrente sanguíneo y se multiplican a un ritmo que supera la capacidad del sistema reticuloendotelial para eliminarlos. Esta invasión puede producirse desde un foco infeccioso extravascular, a través de los capilares sanguíneos o de los vasos linfáticos, o desde un foco intravascular (endocarditis, infección de catéteres intravenosos o arteriales...). Las bacteriemias pueden ser transitorias, continuas o intermitentes según la forma en que aparecen los microorganismos en la sangre, pero esta distinción es difícil de establecer y poco práctica desde el punto de vista microbiológico. El término bacteriemia de “brecha” se emplea cuando ésta se presenta en un paciente que está recibiendo terapia sistémica con antimicrobianos a los cuales es sensible el microorganismo aislado. Su presencia
puede ser debida a una concentración inadecuada del antimicrobiano en la sangre, a un incorrecto drenaje del foco de infección, a la presencia de endocarditis o infección endovasular, al deterioro de las defensas del huésped, al desarrollo de resistencia al tratamiento antimicrobiano, etc. La incidencia de la bacteriemia depende del tipo de población estudiada (5-30 casos por 1000 pacientes hospitalizados) y puede presentarse a cualquier edad, sobre todo en pacientes con graves enfermedades de base y en los sometidos a maniobras que alteran los mecanismos locales y generales de defensa frente a la infección. Los focos más frecuentes de bacteriemia son el tracto genitourinario, los abscesos, las heridas quirúrgicas, el tracto biliar y los catéteres intravasculares, aunque hasta en un 25% de los casos su foco originario es desconocido. La mayoría de los microorganismos son capaces de invadir el torrente circulatorio. En la actualidad los grampositivos, especialmente estafilococos y enterococos, igualan o superan en frecuencia a los gramnegativos. Ello es debido a múltiples causas, entre las que destacan la utilización de antibióticos de amplio espectro, el uso generalizado de catéteres intravasculares y el empleo de métodos de diagnóstico invasores. Por otra parte, el aumento de pacientes inmunodeprimidos con tratamientos antineoplásicos o con infección por el VIH ha propiciado la aparición de bacteriemias por agentes que en el pasado eran causa muy rara de infección. El diagnóstico definitivo de la bacteriemia se establece cuando se aísla el microorganismo causal en la sangre del enfermo mediante el cultivo de ésta. El aislamiento del agente responsable es trascendente, además, para conocer su sensibilidad a los antimicrobianos e instaurar el tratamiento o las modificaciones necesarias a la terapia empírica ya establecida. En ocasiones puede orientar el diagnóstico de enfermedades como la neoplasia de colon (asociada a bacteremia por Streptococcus bovis ), endocarditis (estreptococos del grupo viridans ) e incluso infeción por el VIH ( Salmonella , enterococo). Por otra parte, permite, en la mayoría de las ocasiones, la diferenciación de los casos de verdadera bacteriemia de aquellos en los que la positividad es debida a un inadecuado procedimiento de extracción y procesamiento.
3. INDICACIONES DE LOS HEMOCULTIVOS Sería imposible detallar todas las situaciones en las que se deben extraer hemocultivos, pero, de forma general, deben realizarse, antes de la administración de la terapia antimicrobiana sistémica, siempre que exista sospecha clínica de sepsis, meningitis, osteomielitis, pielonefritis, infección intraabdominal, artritis, infecciones graves de la piel y tejidos blandos, neumonía, endocarditis y fiebre de origen desconocido (absceso oculto, fiebre tifoidea, brucelosis, tularemia, etc.). Los signos que orientan
vista coste/beneficio e incrementa innecesariamente el trabajo del laboratorio. No obstante, en los pacientes con sospecha de endocarditis sobre prótesis, donde puede ser difícil interpretar el aislamiento repetido de estfilococos coagulasa negativa, o en casos de endocarditis con hemocultivos inicialmente negativos que pueden ser debidos a microorganismos de difícil crecimiento, puede ser útil la disponibilidad de un número mayor de extracciones. La extracción debe realizarse lo antes posible después de la aparición de los síntomas (fiebre, escalofríos...) teniendo en cuenta que las bacterias son eliminadas rápidamente de la sangre por las células del sistema reticuloendotelial. Por esta misma razón no se recomiendan extracciones separadas por periodos de tiempo concretos, al contrario, un estudio ha demostrado que se obtienen similares resultados cuando se extraen los hemocultivos simultáneamente que cuando se extraen separados por periodos de tiempo arbitrarios durante 24 horas. Aunque la bacteriemia asociada a la endocarditis se suele acompañar de una baja cantidad de microorganismos en la sangre, diversos estudios demuestran que no es necesario un número mayor de hemocultivos que el recomendado para diagnosticarla. Siempre que sea posible, las extracciones deben realizarse antes de la administración de antimicrobianos.
4.3. VOLUMEN Y DILUCIÓN DE LA SANGRE De todas las variables que influyen en el aislamiento de una bacteria u hongo en un hemocultivo, el volumen de sangre cultivada es la más importante debido al bajo número de microorganismos presentes en la mayoría de las bacteriemias. La mayor parte de los escasos recuentos realizados muestran cifras próximas a 10 UFC/ml de sangre o inferiores y muy rara vez se superan 100 UFC/ml. En niños las cifras son muy variables. Se han descrito recuentos superiores a 1.000 UFC/ml en bacteriemias por Haemophilus influenzae o Neisseria meningitidis y por el contrario bacteriemias con escasísimo número de microorganismos. El volumen recomendado por cada venopunción en adultos es de 10 ml, ya que con volúmenes menores se ha demostrado una disminución del índice de positividad. Se considera que el índice de positividad aumenta entre el 3-5% por cada mililitro adicional de sangre cultivada. Sin embargo, la recomendación de elevar el volumen de sangre por extracción no se aplica, en cierta medida por la anemia que se puede provocar al paciente y para mantener la proporción de volumen sangre/medio de cultivo. En neonatos y niños, se ha preconizado que la mayor cantidad de bacterias presentes en sangre
permite que con volúmenes considerablemente menores, incluso inferiores a 1 ml, se obtengan resultados aceptables y comparables a los de los adultos. Sin embargo, algunos trabajos han demostrado que la bacteriemia de bajo nivel es muy común en la población pediátrica y que el volumen de sangre para detectarla debe ser proporcional al peso (al volumen de sangre total) y a la edad. Se recomienda cultivar un volumen de sangre aproximadamente del 4,5% del volumen total de sangre del paciente. La dilución de la sangre en el medio de cultivo es necesaria para neutralizar sus propiedades bactericidas. En los pacientes en tratamiento con antimicrobianos esta dilución permite, además, conseguir que la presencia de éstos se reduzca hasta alcanzar concentraciones subinhibitorias. La dilución final recomendada es de 1/5 a 1/ (volumen/volumen) ya que diluciones <1/5 reducen la positividad.
5. TRANSPORTE DEL HEMOCULTIVO AL LABORATORIO Cada hemocultivo o extracción (dos frascos) con la sangre inoculada debe ser debidamente identificado con los datos del paciente (número de historia clínica, nombre y apellidos, servicio, planta, número de cama), así como el nombre del médico que lo solicita, el diagnóstico del paciente, el tratamiento antimicrobiano que está recibiendo y el tipo de análisis que se requiere (hemocultivo convencional o para microorganismos de crecimiento lento). También se hará constar el número de teléfono del control de enfermería en el que se encuentre ingresado para poder informar los resultados preliminares de los hemocultivos en caso de positividad. Si los hemocultivos se extraen en el Servicio de Urgencias y el paciente es dado de alta, se anotará el número de teléfono donde pueda ser localizado en caso de positividad del hemocultivo. Los frascos, con su debida identificación, deben transportarse al laboratorio inmediatamente. Sólo deben mantenerse a temperatura ambiente durante cortos periodos de tiempo para no afectar la posterior recuperación de los microorganismos. Si no pueden ser enviados inmediatamente al laboratorio se incubarán en una estufa a 35-37ºC hasta ese momento. Los hemocultivos que van a ser procesados en sistemas automáticos pueden mantenerse a temperatura ambiente o a 35-37ºC. El tiempo máximo que pueden permanecer a temperatura ambiente antes de ser introducirlos en el sistema no ha sido definido con exactitud, pero nunca debe superar las 18 h. Si han sido incubados a 35-37ºC, deben ser introducidos en los aparatos automáticos antes de que transcurran 12 h. En los casos en que la introducción de un hemocultivo en un sistema automático se demore más de 18 h, sobre todo si ha estado incubado a 35-37ºC, debe realizarse un subcultivo ciego para evitar un posible
resultado falso negativo. Ello es debido a que los microorganismos pueden haber crecido hasta llegar a la fase de meseta y no ser detectados por el sistema. Los hemocultivos nunca deben ser refrigerados.
6. RECEPCIÓN Y REGISTRO DE LOS HEMOCULTIVOS 6.1. INSPECCIÓN INICIAL En cuanto se reciben los hemocultivos en el laboratorio, y antes de ser introducidos en los aparatos automáticos, los hemocultivos deben ser examinados cuidadosamente para comprobar que pueden ser manejados con seguridad, que estén íntegros, sin roturas o fisuras, que su identificación es correcta, que el volumen de sangre es adecuado y para detectar macroscópicamente signos de crecimiento. Si éstos últimos no existen, los frascos se introducirán rápidamente en los aparatos automáticos para evitar el retraso en el crecimiento de los microorganismos.
6.2. CRITERIOS DE RECHAZO En general, no se rechazará nunca un hemocultivo dada la importancia del diagnóstico de la bacteriemia, salvo en el caso en que haya serias dudas en cuanto a la identificación de la muestra o los frascos estén dañados y contaminados. En el caso de graves deficiencias en el envío de la muestra se contactará con el servicio que la remite para solucionarlas y después se procesará. Los hemocultivos aceptados para ser procesados se registrarán en el sistema informático utilizado por el laboratorio.
6.3. NORMAS DE SEGURIDAD Existe un significativo riesgo biológico para el personal sanitario derivado de la extracción, transporte, manejo y eliminación de los hemocultivos, sobre todo por la manipulación de las agujas. El personal por lo tanto deberá seguir de manera estricta las normas contenidas en el Manual de Seguridad del Laboratorio de Microbiología Clínica (ver Procedimientos en Microbiología Clínica. Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. Nº 10: Seguridad en el Laboratorio de Microbiología Clínica).
7. PROCESAMIENTO DE LOS HEMOCULTIVOS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 7.1. MÉTODOS DE HEMOCULTIVOS En el procedimiento número 3 referido anteriormente se describía exhaustivamente el método convencional (manual) de procesamiento de hemocultivos basado en el sistema de dos frascos descrito a mediados del siglo pasado. En la actualidad, aunque el concepto básico sigue siendo el mismo, se han desarrollado nuevos métodos cuya descripción es el objetivo de este nuevo
procedimiento. Por todo ello, se reseñará someramente el método manual para detallar más ampliamente los nuevos sistemas automáticos. 7.1.1. Métodos manuales 7.1.1.1. Convencional. Es un método técnicamente muy simple que se basa en la observación macroscópica de los signos de crecimiento de una pareja de frascos con medio de cultivo líquido en los que se ha inoculado la sangre del paciente. Existe una amplia variedad de medios de cultivo. Los más frecuentemente utilizados son caldo triptosa soja, Columbia, infusión cerebro corazón, Brucella , tioglicolato y caldo de peptona suplementado y en ocasiones medios con resinas para neutralizar los antimicrobianos cuando el paciente está recibiendo tratamiento antibiótico previo. Estudios comparativos han demostrado que no existe un medio de cultivo que pueda considerarse superior a todos los demás.
Los frascos de hemocultivo llevan incorporado un anticoagulante, la mayoría SPS (polianetol sulfonato sódico) a una concentración del 0,006 al 0,050%, que inhibe la actividad bactericida del suero humano y puede dificultar el crecimiento de algunos microorganismos como Neisseria spp. El medio de cultivo se embotella al vacío con una atmósfera que contiene cantidades variables de CO 2. El potencial de óxido-reducción del medio, si no se ventila, es lo suficientemente bajo como para permitir el crecimiento de bacterias anaerobias. Uno de los dos frascos, después de la inoculación, se ventila por medio de una aguja, permitiendo la entrada de oxígeno atmosférico en su interior y la creación de una atmósfera aerobia. La temperatura de incubación oscila entre los 35º y los 37ºC, la que más se aproxima a la temperatura corporal y la que demuestra un mayor aislamiento de microorganismos durante un período más corto. La mayoría de los potenciales patógenos responsables de bacteriemia se aísla en los hemocultivos entre las 18 y 72 horas siguientes del inicio de su incubación. Más del 95% de los microorganismos se aíslan durante la primera semana, lo que motiva que se mantenga la incubación durante 7 días. Existen, no obstante, algunos patógenos y situaciones en los que se precisa más tiempo para su crecimiento como los hongos, microorganismos del género Brucella y algunos microorganismos causantes de endocarditis ( Cardiobacterium , Eikenella ...) por lo que, ante la sospecha de cualquiera de estas circunstancias, se prolonga la incubación hasta 4 semanas. Los frascos se observan diariamente para detectar signos visibles de crecimiento bacteriano como el enturbiamiento del medio, la hemólisis de los hematíes, la producción de gas o la formación de colonias en el fondo del frasco. No obstante, sólo se detecta crecimiento macroscópico a partir de 10
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UFC/ml. El problema de la detección macroscópica,
medio, que difunde a la atmósfera del frasco. En esta atmósfera se mide periódicamenrte el nivel de 14 CO (^2)
y se expresa como un índice de crecimiento cuando se compara con los niveles de CO 2 en frascos de control. La lectura está totalmente automatizada y se realiza por medio de una cabeza móvil provista de dos agujas que perforan los tapones de goma de los frascos. Su principal inconveniente es el manejo y posterior eliminación de los residuos radiactivos. En la actualidad ha sido superado por otros sistemas y sólo se utiliza para el cultivo de micobacterias. Los sistemas Bactec NR-660 y NR-730 no radiométricos, muy parecidos al anterior, detectan el CO 2 por espectrometría de infrarrojos. Utilizan un agitador para los frascos aerobios en las primeras 24-48 h. Se recomiendan dos lecturas diarias los primeros 3 días y una lectura diaria hasta que se cumplan 5-7 días. Estos sistemas han sido desplazados por los de monitorización continua. 7.1.2.2. Sistemas automáticos de monitorización continua. En los últimos años se han introducido varios sistemas comerciales que, eliminando toda manipulación, realizan agitación contínua de los frascos, monitorización contínua con notificación inmediata de los resultados positivos y utilizan técnicas no invasoras para la lectura. Los que se describen a continuación son los más ampliamente utilizados. Se basan en la detección de la producción de CO 2 por los microorganismos y difieren en el método de detección de éste, en la capacidad de los frascos, en el tipo de medio de cultivo utilizado, en la frecuencia de lectura y en la capacidad máxima de los incubadores (ver detalles en las tablas 1 , 2 y 3 ). Los datos obtenidos en cada lectura se transmiten a un ordenador donde se almacenan y se analizan según sofisticados algoritmos que determinan cuándo se produce crecimiento bacteriano, a la vez que minimizan el número de falsos positivos y falsos negativos. Todos los sistemas han demostrado su utilidad en la detección de la bacteriemia. El Bactec-9240 (Becton Dickinson) es un sistema totalmente automático, no invasor, de agitación continua, que se compone de un incubador, un detector y un ordenador. El CO 2 producido por el metabolismo bacteriano reacciona con un material fluorescente situado en el fondo del frasco del hemocultivo, lo que modula la cantidad de luz que es absorbida por un sensor. Los fotosensores miden el nivel de fluorescencia, que se corresponde con la cantidad de CO 2 producida por el microorganismo. Esta medida es interpretada por el sistema de acuerdo con unos parámetros programados. Este sistema realiza una lectura de todos los frascos cada 10 minutos y mediante un sistema luminoso de alarma indica los frascos positivos detectados en cada lectura. El BacT/Alert (Organon Teknica) fue el primer sistema comercial no invasor de agitación y monitorización contínua de cada frasco. Detecta el aumento y/o nivel total de CO 2 producido por el
crecimiento microbiano utilizando un sensor colorimétrico interno pegado al fondo de los frascos. A medida que cambia el color del sensor, la cantidad de luz reflejada se incrementa y es cuantificada como un aumento del voltaje. Las señales se analizan en un ordenador por medio de un algoritmo que utiliza tres criterios como evidencia de crecimiento. La lectura se realiza cada 10 minutos. El sitema Vital (bioMerieux) difiere de los anteriores en que incorpora un indicador fluorescente en el medio de cultivo. Como consecuencia del metabolismo microbiano se producen cambios en el pH, en el potencial redox o en el nivel de CO 2 que provocan una disminución de la fluorescencia del indicador. Esta fluorescencia se lee cada 15 minutos por medio de un detector diodo/fotón luminescente no invasor. Algunos trabajos han demostrado una cierta dificultad de este sistema en la detección de las levaduras. El ESP (Difco Laboratories) es un sistema automático no invasor en el que los frascos se colocan en cajones y los de anaerobios no se agitan. Monitoriza cada frasco cada 12 minutos y el crecimiento se mide por un método manométrico que detecta el consumo y/o la producción de gas.
7.2. HEMOCULTIVOS POSITIVOS 7.2.1. Tinción de Gram y otras tinciones Cuando, por el método convencional, en un hemocultivo se observan signos de crecimiento, o los sistemas automáticos lo señalan como positivo, inmediatamente deben aspirarse asépticamente de 3 a 5 ml de caldo del frasco, introducirlos en un tubo estéril y depositar una gota en un portaobjetos para realizar una tinción con la técnica de Gram (ver tabla 4 ). Si no se observan microorganismos puede ser útil realizar una segunda tinción con naranja de acridina que es capaz de detectar un número menor de bacterias. Esta técnica ha demostrado su utilidad en bacteriemias por Brucella y Campylobacter. 7.2.2. Subcultivos El material aspirado, independientemente del resultado obtenido en la tinción de Gram, debe ser subcultivado en distintos medios (agar sangre, agar chocolate y agar sangre enriquecido) que se incubarán a 35-37ºC en diferentes atmósferas (aerobia, con 5% de CO 2 y anaerobia, respectivamente) y períodos de tiempo (24 h el agar sangre y el agar chocolate, y 48-72 h el agar sangre enriquecido en anaerobiosis). En ocasiones puede ser necesaria la incubación del agar chocolate 48 h. Teniendo en cuenta la morfología de los microorganismos observada en la tinción de Gram se deben realizar, además, subcultivos en medios específicos, por ejemplo, en agar Sabouraud si se observan levaduras, e incubar a diferentes temperaturas, 30ºC en caso de sospecha de hongos. 7.2.3. Identificación y antibiograma preliminares Con objeto de obtener resultados lo antes posible, se deben realizar pruebas de identificación
Tabla 1. Sistemas comerciales automáticos de hemocultivos
Sistema Indicador del crecimiento Mecanismo de detección
Monitorización contínua
Bactec 460 Producción de CO 2 Radiométrico No
Bactec 660 Producción de CO 2 Infrarrojos No
Bactec-9240 Producción de CO 2 Fluorescencia Sí
BacT/Alert Producción de CO 2 Colorimétrico Sí
Vital Producción de CO 2 , cambio de pH o potencial redox Fluorescencia Sí
ESP Producción y/o consumo de gas Manométrico Sí
Tabla 2. Características de los sistemas automáticos de monitorización contínua de hemocultivos
Sistema Nº de frascos por unidad
Máximo unidades (frascos)
Frecuencia lectura (minutos)
Tipo de agitación/ velocidad Bactec-9240 240 5 (1200) 10 Balanceo/30 a
BacT/Alert 120-240 6 (1440) 10 Balanceo/34 a
Vital 200-400 3 (1200) 15 Sinusoidal/150a
ESP 128-384 5 (1920) 12 (aerobios) Rotación/160 b
24 (anaerobios)
a: Ciclos/minuto. b: Revoluciones/minuto.
Tabla 4. Identificación preliminar de microorganismos de hemocultivos basada en la tinción de Gram
Tinción de Gram Identificación preliminar
Gram (+) en racimos TSI, DNAsa o coagulasa, novobiocina, antibiograma en agar Mueller Hinton Gram (+) en diplos o cadenas Optoquina, bacitracina, bilis-esculina, antibiograma en agar sangre
Cocos
Gram (-) Antibiograma en agar chocolate incubado en CO (^2) ( Neisseria )
Bacilos Gram (+) y corineformes Esculina, antibiograma en agar sangre Gram (-) Pruebas bioquímicas de identificación, antibiograma en agar Mueller Hinton
Cocobacilos Gram (-) Antibiograma en agar chocolate incubado en CO (^2) ( Haemophilus )
Levaduras Agar Saboureaud+cloranfenicol, agar Saboureaud+cloranfenicol+cicloheximida
Flora mixta Gram (+) y Gram (-) Agar sangre+ácido nalidíxico, agar MacConkey
presuntiva partiendo del caldo aspirado. Cuando se trata de bacteriemias monomicrobianas (la mayoría de las veces), dichas pruebas rápidas suelen dar resultados comparables con los que aporta la identificación definitiva en más del 90% de los estudios y en un tiempo incluso de 4 horas. En el caso de que la tinción de Gram demuestre la presencia de bacterias grampositivas la morfología de las mismas tiene un alto valor predictivo. Al tiempo que se procede a la identificación, a partir del caldo de cultivo también debe realizarse un antibiograma preliminar, que permita disponer lo más rápido posible la sensibilidad del microorganismo. Estos resultados tienen un gran valor en el manejo inicial del paciente con bacteriemia. La correlación de este procedimiento con los resultados del antibiograma definitivo realizados a partir de colonias aisladas oscila entre 87 y 99,3% en diversos estudios. En cualquier caso, las discrepancias existentes interesan sólo en la medida en que puedan interferir lesivamente en la adecuada terapéutica del paciente. Es posible también inocular el caldo de cultivo directamente en sistemas automáticos de identificación y estudio de sensibilidad. Algunos permiten la lectura de los resultados a las tres horas de incubación. 7.2.4. Informe preliminar El hallazgo de un hemocultivo positivo puede ser crítico por lo que el resultado obtenido de la tinción de Gram debe informarse inmediatamente por vía telefónica al médico responsable del enfermo y dejar registrado el día, la hora y el nombre de la persona que recibe el informe. En dicho informe se especificará la morfología de los microorganismos, el resultado de la tinción de Gram, el número de hemocultivos en los que se observan con referencia al total de los extraídos y la fecha de obtención de los
mismos. Debe informarse, en cuanto se disponga de ella, la sensibilidad del microorganismo a los antimicrobianos según el antibiograma inicial. El informe verbal debe ir seguido de uno escrito informando en los mismos términos y advirtiendo de que será seguido del informe definitivo. 7.2.5. Identificación e informe definitivo Tras el crecimiento de los microorganismos en los medios de cultivo se identificarán y se realizarán pruebas de sensibilidad por los métodos estándar. Los microorganismos considerados como contaminantes se identificarán sólo al nivel de genero. Obtenida la información definitiva, se emitirá un informe escrito. Se informará también verbalmente en el caso de que los resultados sean discrepantes con los proporcionados previamente.
7.3. INFORME DE LOS HEMOCULTIVOS NEGATIVOS Los hemocultivos en los que no se aíslan microorganismos, transcurrido el período de incubación establecido, se informarán por escrito como estériles o negativos. Se puede añadir una frase en la que consten los días de incubación, por ejemplo: “Estéril a los 5 días de incubación”.
8. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Un hemocultivo puede ser positivo sin que ello represente un episodio verdadero de bacteriemia. Es frecuente que la propia microbiota cutánea del enfermo o del personal que realice la toma del hemocultivo pueda contaminar la sangre en el momento de la extracción. También el laboratorio, durante la manipulación de los hemocultivos, puede inocular de forma accidental los microorganismos. Si la técnica de extracción, transporte y procesamiento es correcta, no debe contaminarse más de un 3% de
todas las extracciones. Denominamos bacteriemia verdadera a aquella producida por microorganismos realmente presentes en la sangre de los pacientes y falsas bacteriemias a las causadas por una contaminación accidental de los medios de cultivo. La distinción entre la verdadera bacteriemia y la que no lo es constituye un asunto de la máxima importancia y trascendencia para el paciente. Uno de los datos orientativos más importante lo constituye la propia identidad de los microorganismos aislados. Microorganismos patógenos como Staphylococcus aureus , Escherichia coli y otras enterobacterias, Pseudomonas aeruginosa y Streptococcus pneumoniae son responsables de bacteriemias verdaderas en más del 90% de los casos. Por el contrario, es dudoso el papel que representan los microorganismos que forman parte de la microbiota del paciente como los estafilococos coagulasa negativa, Streptococcus del grupo viridans, Corynebacterium spp., Propionibacterium acnes, Bacillus spp. y algunas especies de Clostridium que, en conjunto, suponen menos del 5% de las bacteriemias verdaderas. Sin embargo, algunos de estos microorganismos pueden ser responsables de auténticas bacteriemias en algunas situaciones y por tanto, su identidad no es un dato suficiente para establecer el criterio de significación clínica. Es preciso recurrir al número de hemocultivos en que se repite el aislado y en este sentido, sin que el dato sea definitivo, es indudable que la repetición de la misma bacteria en más de una extracción (suponiendo que todas las extracciones no se han realizado desde una misma vía contaminada), aumenta la probabilidad de que se trate de una bacteriemia verdadera. Por el contrario, la presencia de un solo hemocultivo positivo de extracciones seriadas en un corto período de tiempo sugiere una contaminación. El valor de los hemocultivos cuantitativos para predecir la bacteriemia verdadera también ha sido cuestionado, así como los hemocultivos obtenidos secuencialmente. En el caso de la endocarditis la bacteriemia es continua y si un cultivo es positivo todos deberían serlo también. Sin embargo, la mayor parte de las bacteriemias son transitorias y por lo tanto no es de extrañar que sólo en el 70-80% de los casos los hemocultivos sean positivos. En general es de ayuda también para la interpretación la existencia de cuerpos extraños o focos infecciosos de los que se haya aislado el mismo microorganismo que en la sangre. En la mayoría de las ocasiones, sin embargo, el laboratorio no dispone de elementos suficientes para establecer con seguridad la significación de la bacteriemia. El microbiólogo debe compartir la información que posee con el clínico responsable del paciente para, junto con los datos clínicos de éste, valorar conjuntamente los resultados obtenidos.
9. MICROORGANISMOS Y SITUACIONES ESPECIALES Si la colaboración entre el clínico y el microbiólogo es siempre necesaria, mucho más ante la sospecha de
una infección cuyo agente etiológico es infrecuente y, además, de difícil aislamiento y crecimiento. La mayoría necesitan medios de cultivos especiales por sus requerimientos nutritivos y su incubación debe ser prolongada debido a su lento crecimiento. En alguno de estos procesos infecciosos el estudio serológico es indispensable para el diagnóstico; en otros es imprescindible aplicar técnicas de biología molecular que proporcionan información con más celeridad que el cultivo. Estos microrganismos, a veces responsables de las llamadas endocarditis con hemocultivo negativo, incluyen Brucella , Haemophilus, Cardiobacterium, Eikenella, Kingella, Bartonella, Abiotrophia , etc_._
9.1. BRUCELOSIS Aunque ha disminuído, en España la brucelosis es todavía una enfermedad que se debe tener presente. Para el aislamiento de Brucella se ha utilizado clásicamente el medio de cultivo de Castañeda o cualquier frasco de hemocultivo con medio bifásico. La ventaja es que permiten resembrar el medio líquido sobre la fase sólida sin necesidad de abrir o pinchar el frasco. La lectura se realiza diariamente y la bacteria se detecta generalmente entre 4 y 7 días. Las colonias tienen un aspecto característico, translúcidas y agrupadas de forma arrosariada, también llamada de cielo estrellado. Actualmente, con los sistemas automáticos el microorganismo se detecta en los frascos aerobios más rápidamente. Es recomendable, sin embargo, prolongar el período de incubación hasta 21 días, realizar un subcultivo en agar sangre y/o agar chocolate, independientemente de la técnica utilizada, e incubar la placa 3 ó 4 días antes de descartar el hemocultivo como negativo. Debido al riesgo que representa para el personal del laboratorio, se exige un nivel 2 de seguridad para procesar muestras sospechosas de contener Brucella y un nivel de seguridad 3 para manipular los cultivos de este microorganismo.
9.2. TULAREMIA La tularemia es una infección poco frecuente y el aislamiento de Francisella tularensis , su agente causal, en un hemocultivo es extremadamente raro ya que la bacteria sólo está en la sangre en la fase aguda de la enfermedad. Los frascos deben incubarse 14 días subcultivándolos, cada 4 días y al final del período de incubación, en agar sangre suplementada con glucosa y cisteína. También se pueden utilizar agar chocolate enriquecido con IsoVitalex o agar charcoal con extracto de levadura. Los niveles de seguridad requeridos son los mismos que los descritos para Brucella. Habitualmente, el diagnóstico de tularemia se realiza a través del estudio serológico.
9.3. LEPTOSPIROSIS La leptospirosis es una infección aguda producida por espiroquetas del género Leptospira que se presenta con un amplio espectro de manifestaciones clínicas. El microorganismo suele estar presente en la sangre en la fase aguda, la primera semana de la enfermedad. El cultivo se realiza añadiendo de 1 a 3 gotas de sangre fresca del paciente a 5 ml de medio de Stuart o
microorganismos en la tinción de Gram. Este hecho debe hacer sospechar la posibilidad de la presencia de micoplasma. También se puede realizar una tinción de Dienes de las microcolonias.
9.9. MICOBACTERIAS La sangre no era la muestra más adecuada para diagnosticar una micobacteriosis y constituía un hecho anecdótico el aislamiento de Mycobacterium tuberculosis y otras micobacterias a partir de la misma. Sin embargo, la aparición del VIH puso de relieve la existencia de nuevas formas de enfermedad tuberculosa y paralelamente la presencia de micobacterias en sangre se hizo cada vez más frecuente, por lo que está indicada su investigación. El primer sistema utilizado para este fin fue el Bactec 460 radiométrico, sustituido en la actualidad por los sistemas de monitorización continua que utilizan frascos específicos para micobacterias. Aun no siendo los medios apropiados, la incubación prolongada hasta 6 semanas de los frascos aerobios de los diferentes sistemas permite también detectar la presencia de M. tuberculosis y Mycobacterium avium. Otro método muy útil es el de lisis-centrifugación. Puede ser eficaz realizar una combinación de dos métodos: en primer lugar procesar la sangre por la técnica de lisis- centrifugación y sembrar el sedimento después en un frasco de los sistemas automáticos con el fin de acortar el período de incubación. Actualmente, con el tratamiento antiretroviral, han disminuido las infecciones oportunistas en los pacientes con sida, por lo que también ha descendido el número de micobacteriemias en estos pacientes.
9.10. LEISHMANIASIS En los países mediterráneos es frecuente la leishmaniasis, parasitosis del sistema mononuclear fagocítico causada por Leishmania donovani. Es otra de las infecciones que se incrementaron con la aparición del SIDA y que ha vuelto a disminuir con los actuales tratamientos antivirales. El diagnóstico requiere la visualización de Leishmania en una tinción de Giemsa a partir de muestras obtenidas de médula ósea, biopsia de bazo o adenopatía, o bien el cultivo de la misma. El medio clásico utilizado es el NNN, al cual hay que añadir una tercera parte de su volumen de sangre desfibrinada de conejo. Es algo laborioso de preparar y fácil la contaminación del mismo. Otros medios útiles son el medio Drosophila de Schneider, al que se añade suero fetal bovino a una concentración del 30%, y el medio MEM (Eagle minimal essential medium) al que también se le adiciona suero fetal bovino. Se inoculan dos o tres gotas de la muestra por tubo de medio preparado y se dejan a temperatura ambiente durante 1 mes. Se realiza un examen microscópico del medio de cultivo a 400 aumentos, colocando una gota entre porta y cubreobjetos el tercer día de incubación y después una vez a la semana.
9.11. HONGOS Clásicamente se ha recomendado el medio bifásico o Castañeda para la recuperación de hongos. En los
últimos 20 años los múltiples avances en las técnicas de hemocultivo, entre ellos, la mejor calidad de los medios empleados, tanto en la técnica convencional como en los sistemas automáticos, la ventilación de los frascos aerobios, el desarrollo de medios de cultivo con resinas, así como los de alto volumen, y la agitación continua de los frascos, han permitido diagnosticar un mayor número de fungemias. Un método muy útil es el de lisis-centrifugación, que ha demostrado una gran efectividad para recuperar hongos, especialmente Histoplasma capsulatum , ya que permite seleccionar los medios de subcultivo. Las levaduras son responsables de la mayoría de las fungemias, siendo el género Candida el más frecuente. En ocasiones y dependiendo del medio de cultivo empleado debe ventilarse el frasco aerobio. Los hongos levaduriformes se aíslan en los frascos aerobios de hemocultivo con relativa rapidez, no después de 5-7 días de incubación. No obstante, si se sospecha que el agente causal es un hongo dimórfico o filamentoso es recomendable prolongar su incubación hasta 30 días a 22-30ºC con un subcultivo final antes de descartar como negativo. Para recuperar Malassezia furfur el medio debe ser suplementado con sustancias que aporten ácidos grasos de cadena larga como el aceite de oliva. Los pacientes con mayor riesgo de fungemia son los inmunodeprimidos, especialmenten hematológicos y trasplantados. En los portadores del VIH debe sospecharse la posibilidad de que el causante de la fungemia sea Cryptococcus neoformans.
9.12. VIRUS El hemocultivo para detectar virus se realiza habitualmente en pacientes trasplantados de órgano sólido o de médula ósea para el control de citomegalovirus (CMV). A partir de monocitos y polimorfonucleares del paciente se inoculan frascos de hemocultivo convencionales y los denominados “shell vials”. La alternativa al cultivo es la detección directa de CMV (antigenemia) en leucocitos, no aconsejable en neutropénicos, y la detección del ADN de CMV por PCR en leucocitos o plasma. Se realizan también hemocultivos para detectar viremias causadas por Herpes simplex, VIH y virus de la hepatitis C y con menor frecuencia para otros virus. No está bien definido el volumen de sangre por hemocultivo ni el número de los mismos. En general se extraen entre 2 y 5 ml de sangre con EDTA que se transportan de inmediato al laboratorio de Microbiología (ver procedimientos específicos de virología).
9.13. ENDOCARDITIS Cuando se sospecha una endocarditis infecciosa es aconsejable realizar tres hemocultivos con un volumen de sangre por extracción no inferior a 10 ml. Su finalidad es detectar la bacteriemia continua y descartar agentes etiológicos contaminantes como estafilococo coagulasa negativa o corinebacterias, que al mismo tiempo suelen ser los microorganismos responsables de la endocarditis protésica. Aunque todos los microorganismos pueden causar endocarditis infecciosa, los más habituales (estreptococos,
estafilococos) suelen crecer en las primeras 48 horas. Pasado este tiempo, si el paciente no ha recibido tratamiento antimicrobiano se sospechará la, mal llamada en algunos casos, endocarditis con hemocultivo negativo, como la causada por microorganismos del grupo HACEK, Brucella, Abiotrophia ... Los frascos deberán incubarse entre 2 y 4 semanas, subcultivando en medios específicos al final de la incubación. En pacientes con hemocultivo negativo debe realizarse al mismo tiempo un estudio serológico frente a Coxiella burnetii, Legionella, Brucella, Bartonella y Chlamydia , particularmente si han recibido tratamiento antimicrobiano previo. En este caso, si el paciente mantiene un buen estado hemodinámico, lo indicado es interrumpir el tratamiento antimicrobiano y repetir los hemocultivos como mínimo 48 h después de la suspensión.
9.14. BACTERIEMIA ASOCIADA A CATÉTER El 100% de los pacientes ingresados en áreas de vigilancia intensiva son portadores de catéteres intravasculares (CIV) y la mayoría de ellos están pluricateterizados. No sólo son portadores de CIV los pacientes ingresados, sino también pacientes en régimen ambulatorio sometidos a hemodiálisis o quimioterapia. Los datos clínicos son poco útiles para el diagnóstico de la bacteriemia asociada a catéter por su baja sensibilidad y especificidad, por lo que se requiere la confirmación microbiológica para tener un diagnóstico de certeza. En breve va a ser publicado un procedimiento específico titulado “Infección asociada a catéter”, que el lector interesado en el tema puede revisar. No obstante, a continuación se resumen las técnicas microbiológicas empleadas para el diagnóstico de las bacteriemias asociadas a catéter. Procedimientos diagnósticos sobre catéteres retirados Cultivo cualitativo de la punta del catéter. Esta técnica consiste en cortar asépticamente el extremo distal del catéter e introducirlo en un tubo con medio líquido. Es sencilla y sensible, aunque no permite cuantificar el número de UFC, por lo que no se recomienda en la actualidad. Cultivo semicuantitativo de la punta del catéter. Descrita por Maki, se cultiva la superficie externa de la punta del catéter. Para ello se rueda la punta distal del CIV en una placa de agar sangre con la ayuda de pinzas estériles. Es la técnica de referencia. Cultivo cuantitativo de la punta del catéter. Técnicas más complejas descritas por Cleri, Brun-Buisson, Sheretz y Liñares. Procedimientos diagnósticos manteniendo el catéter. Más del 70% de los catéteres retirados por sospecha de infección son estériles, por lo que son necesarios procedimientos diagnósticos que no obliguen a disponer del catéter. Los cultivos de la piel en el punto de inserción y de la conexión, el cepillado endoluminal del catéter y los métodos que comparan los resultados obtenidos de los hemocultivos de sangre extraída de una vena periférica y los realizados a través del catéter son los procedimientos más utilizados. En cuanto a estos últimos, concretamente, se ha propuesto
comparar el tiempo de crecimiento de los hemocultivos extraidos de una vena periférica y de los extraídos a través del catéter.
10. CONTROL DE CALIDAD 10.1. MANUALES Y NORMAS El laboratorio de Microbiología debe poseer, debidamente actualizado, un manual de procedimientos o guía en la que se describa exhaustivamente la metodología de los hemocultivos. Además, deberá dictar normas específicas para el personal sanitario en relación con la asepsia de la piel, la venopunción y la inoculación de los frascos de hemocultivo, así como recomendaciones sobre el número e intervalo de extracción de los hemocultivos, el volumen de sangre para cultivar y la selección del tipo de frasco o medio de cultivo.
10.2. ANÁLISIS DE LOS DATOS Periódicamente, y al menos una vez al año, deberán evaluarse los resultados obtenidos del procesamiento de los hemocultivos. El análisis de estos datos proporciona una valiosa información sobre el control de calidad interno del laboratorio. Se evaluará la tasa de positividad, la de falsos positivos y la cifra total y el tipo de microorganismos aislados. La tasa de contaminación, si los hemocultivos son obtenidos y procesados correctamente, no debe superar el 3% del total de hemocultivos. Si es mayor deberán establecerse medidas como informar periódicamente al personal sanitario de la importancia de una técnica aséptica de extracción de la sangre, utilizar la misma aguja para la extracción de la sangre y la inoculación del frasco, y controlar y cambiar, si es necesario, los antisépticos empleados. Una tasa de positividad muy baja puede reflejar una excesiva utilización de los hemocultivos. El número de bacteriemias, así como su origen, comunitario o intrahospitalario, y su localización por servicios proporciona datos esenciales para el conocimiento, vigilancia y control de la infección.
11. BIBLIOGRAFÍA
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01 Edición inicial
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Hospital...........................
Hemocultivos Edición Nº 01 Página 2 de 5
1. PROPÓSITO Y ALCANCE El objetivo de este documento es normalizar la realización de los hemocultivos. Su aplicación se extiende desde la extracción de los mismos por el equipo de enfermería que atiende al paciente, cuyo procedimiento debe vigilar y dirigir el responsable del laboratorio de Hemocultivos, hasta la emisión de los resultados. 2. FUNDAMENTO El procesamiento de los hemocultivos constituye una de las prioridades del Servicio de Microbiología Clínica. Las siguientes normas e instrucciones no se conciben como el "estándar de oro" de un laboratorio de hemocultivos, sino que pretenden ser un fiel reflejo del procesamiento de los hemocultivos. Indicaciones - Pacientes con fiebre ≥ 38ºC o cuya temperatura sea inferior a 36ºC. - Pacientes con leucocitosis o leucopenia. - Pacientes con trombopenia o alteraciones de la coagulación de causa no filiada. - Pacientes con infección focal de etiología no aclarada. - Pacientes con deterioro uni o multiorgánico, shock o inestabilidad hemodinámica. - Neonatos ante la mínima sospecha de infección. 3. DOCUMENTOS DE CONSULTA Normas o libro de hemocultivos. Manuales de instrucciones de las técnicas aplicadas. Normas NCCLS de las pruebas de sensibilidad a los antibióticos. Normas de bioseguridad. 4. TOMA DE LA MUESTRA 4.1. PREPARACIÓN DEL MATERIAL En una bandeja se preparará: 1.- Un compresor elástico. 2.- Un paquete de gasas estériles. 3.- Un frasco preferiblemente con solución yodada o povidona yodada y una gasa impregnada en alcohol de 70 °. 4.- Una jeringuilla desechable de 10 ml de capacidad con su correspondiente aguja I.V. 5.- Un juego de dos frascos de hemocultivo (aerobio y anerobio) por cada extracción
4.2. OBTENCIÓN DE LA SANGRE Momento y lugar de la extracción .- Se extraerán 2- hemocultivos con el menor intervalo de tiempo posible después de la aparición de los síntomas utilizando lugares de venopunción diferentes. Cada hemocultivo o extracción consta de dos frascos con tapones de diferente color. Método de la extracción: 1- Levantar la lengüeta plástica de los frascos y limpiar los tapones con una gasa impregnada en solución yodada o povidona yodada. 2- Colocar el compresor al paciente tras elegir la vena a pinchar. Tras ello se limpia con una gasa
impregnada en alcohol de 70° una zona de la piel de un diámetro de 3-5 cm en el lugar elegido para la palpación y los dedos del explorador. Dejar actuar al menos 1 minuto. 3- Pintar ampliamente con povidona la piel de la zona a pinchar (al menos en un diámetro de 10 cm). A continuación se pintarán las yemas de los dedos índice, medio y pulgar de la mano utilizada para la palpación de la vena. El efecto de la povidona no se ejerce de modo total hasta que transcurre el tiempo suficiente para su oxidación (secado). 4- Extraer un mínimo de 10 ml de sangre (5 ml por frasco) en los adultos y la mayor cantidad posible en los niños, a ser posible una cantidad mínima de 2 ml (1 ml por frasco). 5- Introducir 5 ml de sangre en cada uno de los dos frascos correspondientes a esa extracción (aerobio y anaerobio), evitando la entrada de aire, pinchando a través del tapón de goma. Nunca se destapará el tapón de goma que viene sellado con una arandela metálica. Se tendrá la precaución de sujetar bien el émbolo de la jeringa para que la presión del vacío que existe en el frasco no aspire rápidamente más cantidad de sangre que la adecuada ni el aire que pudiera quedar en el fondo de la jeringuilla. Es correcta la utilización del sistema Vacutainer para la extracción de los hemocultivos, teniendo la precaución de extraer los frascos de hemocultivos antes que cualquier tubo para otros fines, ya que se puede contaminar la aguja del sistema Vacutainer y por consiguiente los hemocultivos extraídos con posterioridad. 6- Se rotulará cada frasco con una etiqueta adhesiva en la que figuren el nº de historia, nombre del enfermo y el número de extracción realizada (1º, 2ª ó 3ª), teniendo la precaución de no tapar la etiqueta de código de barras del frasco.
4.3. ENVÍO DE LOS HEMOCULTIVOS AL LABORATORIO 1- Se rellenará un volante para cada extracción (dos frascos). Es absolutamente necesario indicar en los volantes el nombre del paciente, el servicio donde se encuentra ingresado, el número de cama y el número de teléfono del control de enfermería con objeto de informar los resultados preliminares en caso de positividad. Si los hemocultivos son extraídos en el Servicio de Urgencias y el paciente es dado de alta, se anotará en los volantes el número de teléfono del domicilio del paciente o donde pueda ser localizado en caso de positividad.
Sería deseable añadir en los volantes otra información que ayudara a la valoración de la bacteriemia en el laboratorio como si está recibiendo tratamiento antibiótico, la enfermedad de base del paciente, el síndrome clínico que padece en el momento actual y si la infección es de adquisición nosocomial o comunitaria. 2.- Los 4-6 frascos de cada paciente con los 2- volantes se introducirán en una bolsa de plástico y se enviarán inmediatamente al Servicio de Microbiología,
