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Asignatura: salud publica, Profesor: lola lola, Carrera: Enfermería, Universidad: UPV-EHU
Tipo: Apuntes
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I
ISBN: 84-609-7032-
II
INDICE: INDICE DEL DOCUMENTO CIENTÍFICO
Las micobacterias son un grupo de microorganismos de gran importancia clÌnica, ya que existen m˙ltiples especies que son agentes causales de diversas infecciones humanas con una importante morbilidad y mortalidad. Algunas enfermedades, como la tuberculosis y la lepra, han ido ligadas a la historia del hombre. A pesar de los esfuerzos realizados para su control, en la actualidad constituyen uno de los problemas sanitarios de mayor gravedad a nivel mundial. Seg˙n datos de la OMS, cerca de dos millones de personas murieron de tuberculosis en 2002. Se calcula que alrededor de un tercio de la poblaciÛn mundial est· infectada por el bacilo tuberculoso y que cada segundo se infecta una persona m·s. De esta forma las previsiones son desoladoras, ya que se estima que entre 2002 y 2020, cerca de 150 millones de personas enfermar·n y 36 millones fallecer·n por esta enfermedad. No obstante, hay que considerar que existe una gran variabilidad geogr·fica; el mayor n˙mero de casos ocurren en el Sudeste Asi·tico y ¡frica, seguidos por AmÈrica Latina y el Este de Europa. Este hecho est· directamente relacionado con las condiciones socioeconÛmicas y el impacto de la epidemia de la infecciÛn por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en dichas zonas. A ello se une la apariciÛn, en los ˙ltimos aÒos, de cepas resistentes y multirresistentes a los agentes antimicrobianos. La lepra tambiÈn representa un problema de primer orden. La OMS (2001) ha constatado que, aunque existe una disminuciÛn en la prevalencia de la enfermedad, se ha observado un incremento en la incidencia de la misma (>700.000 casos). La mayorÌa de los pacientes se encuentran en Asia, ¡frica y SudamÈrica, especialmente en seis paÌses (83%), siendo la India donde se concentran la mayorÌa de los casos. Por otro lado, las micobacteriosis o enfermedades producidas por otras micobacterias diferentes de Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, han ido tomando un mayor protagonismo. Se ha observado fundamentalmente en los paÌses con un mayor desarrollo econÛmico y tambiÈn con la apariciÛn de la infecciÛn por el VIH. AsÌ, en la ˙ltima dÈcada en EspaÒa, en muchos laboratorios de microbiologÌa estas especies han supuesto entre el 15 y el 30% de los aislamientos micobacterianos. Todo ello junto al creciente desarrollo de nuevas tÈcnicas de cultivo, diagnÛstico y pruebas de sensibilidad, est· condicionando la metodologÌa a emplear por los laboratorios de micobacteriologÌa.
2. CONSIDERACIONES MICROBIOLÓGICAS El gÈnero Mycobacterium es el ˙nico que pertenece a la familia Mycobacteriaceae y al orden Actynomicetales. Las especies de este gÈnero presentan un elevado contenido de G+C (61-71%) en su ADN. Esto es
compartido por otros gÈneros relacionados que tambiÈn poseen ·cidos micÛlicos en la pared celular, como son Gordona , Tsukamurella , Nocardia y Rhodococcus. Las micobacterias son microorganismos aerobios estrictos, inmÛviles, de morfologÌa variable (bacilar o cocoide), que no forman esporas y no poseen flagelos ni c·psula. En cambio, poseen una pared celular gruesa y con un elevado contenido lipÌdico que supone el 60% del peso seco de la misma. Esta pared consta de cuatro capas: la m·s interna es el peptidoglicano con molÈculas de N-acetilglucosamina y ·cido N- glucolilmur·mico con cadenas cortas de alanina o glicina en el caso de M. leprae. Esta capa da rigidez y forma a la bacteria. La segunda posee arabinogalactanos que se encuentran unidos a los ·cidos micÛlicos de la tercera capa. Se trata de ·cidos grasos de cadena larga (60-90 ·tomos de carbono) de gran importancia taxonÛmica. La capa m·s externa se encuentra constituida por lÌpidos como el cord factor (trehalosa 6,6í-dimicolato) y por mucÛsidos. En conjunto, esta composiciÛn de la pared le confiere a la micobacteria una escasa permeabilidad celular, que es responsable, entre otras cosas, de la ineficacia de m˙ltiples agentes antimicrobianos, asÌ como de la caracterÌstica ·cido-alcohol resistencia con determinadas tinciones para su visualizaciÛn microscÛpica. Adem·s, determinados componentes de la pared, como el lipoarabinomanano, intervienen en la patogenia y favorecen la supervivencia del microorganismo en el interior de los macrÛfagos. La gran mayorÌa de las micobacterias de interÈs clÌnico tienen un crecimiento muy lento con un tiempo de multiplicaciÛn de 15 a 18 horas en condiciones favorables. De ahÌ que sean necesarias de 1 a 3 o m·s semanas de incubaciÛn para obtener un crecimiento apreciable en los medios de cultivo convencionales. No obstante existe un grupo de especies que tienen un crecimiento algo m·s r·pido que les permite, entre otras cosas, diferenciarlas del resto. En general las necesidades nutritivas de las micobacterias son sencillas, requiriendo una fuente de carbono (glicerol) y nitrÛgeno (amonio o amino·cidos) asÌ como determinadas sales minerales. Tan sÛlo algunas especies ( Mycobacterium genavense o Mycobacterium haemophilum ) precisan unos suplementos especiales como son micobactina, hemina u otros componentes fÈrricos. Por otro lado, el crecimiento de las micobacterias se ve estimulado por la presencia de CO 2 y ·cidos grasos. Un caso aparte es M. leprae que sÛlo es capaz de crecer en cultivos celulares. Aunque la temperatura Ûptima de crecimiento general suele ser de 35-37∫C, existen determinadas especies que precisan temperaturas de 30∫C ( Mycobacterium marinum, Mycobacterium ulcerans, M. haemophilum ), 42∫C ( Mycobacterium xenopi ) o 52∫C ( Mycobacterium thermoresistibile ) para obtener una mejor tasa de crecimiento.
Tabla 1. ClasificaciÛn modificada de Runyon de las micobacterias m·s frecuentemente aisladas en muestras clÌnicas.
Micobacterias de crecimiento lento MNT de crecimiento rápido Grupo I. Fotocromógenas
Grupo II. Escotocromógenas
Grupo III. No cromógenas
Grupo IV. No cromógenas M. asiaticum M. flavescens M. africanum M. abscessus M. kansasii M. gordonae M. avium M. chelonae M. marinum M. scrofulaceum M. bovis M. fortuitum M. simiae M. szulgai M. gastri M. mucogenicum M. xenopi M. genavense M. peregrinum M. haemophilum M. porcinum M. intracellulare M. malmoense M. nonchromogenicum M. shimoidei M. terrae M. triviale M. tuberculosis M. ulcerans
La detecciÛn de la poblaciÛn infectada se puede realizar mediante la prueba de la tuberculina (PT). Esta sustancia es un derivado proteico purificado (PPD) obtenido de un filtrado de un cultivo de M. tuberculosis esterilizado y concentrado. La prueba est·ndar recomendada por la OMS es la intradermorreacciÛn de Mantoux, que consiste en la inyecciÛn intradÈrmica de 2 UT (unidades internacionales) de PPD-RT23. Esta prueba se basa en la hipersensibilidad que pueden tener las personas que han estado en contacto previo con el bacilo tuberculoso, que han sido vacunadas con el BCG o que han tenido una infecciÛn con MNT. Debido a las limitaciones de especificidad y sensibilidad inherentes a la prueba de la tuberculina, recientemente, se han desarrollado diversos inmunoensayos basados en la detecciÛn de la secreciÛn de InterferÛn (IFN)-gamma por linfocitos T del paciente tras incubarlos con determinados antÌgenos tuberculosos. Aunque estos mÈtodos parecen tener una mayor especificidad, todavÌa est· pendiente el conocer cu·l es el papel exacto que pueden tener en el diagnÛstico de la infecciÛn tuberculosa. La tuberculosis es una enfermedad crÛnica y granulomatosa que suele afectar a nivel pulmonar, aunque puede tener otras muchas localizaciones e incluso ser una enfermedad diseminada (miliar). Estas formas extrapulmonares suelen ser m·s frecuentes en pacientes con una inmunodepresiÛn importante (ej. SIDA). El diagnÛstico de la enfermedad se lleva a cabo en funciÛn de las caracterÌsticas clÌnicas, la radiologÌa, anatomÌa patolÛgica, microbiologÌa y otras pruebas complementarias. Sin embargo la microbiologÌa es fundamental ya que, adem·s de la posible detecciÛn microscÛpica de los bacilos en la muestra, el aislamiento del agente causal en el cultivo y su posterior identificaciÛn sigue siendo la clave del
diagnÛstico definitivo de tuberculosis. Adem·s, se podr·n realizar pruebas de sensibilidad in vitro a los antimicrobianos y posibles estudios moleculares para su vigilancia epidemiolÛgica.
3.2. Mycobacterium leprae. Esta micobacteria es el agente causal de la lepra (enfermedad de Hansen) que, seg˙n estimaciones de la OMS, la padecen cerca de 8 millones de personas en el mundo, fundamentalmente en paÌses en vÌas de desarrollo. India, China, Myanmar, Indonesia, Brasil y Nigeria concentran m·s del 80% de todos los casos. Se trata de una enfermedad crÛnica, granulomatosa y debilitante, que afecta sobre todo a los tejidos corporales m·s frÌos, especialmente la piel y el sistema nervioso perifÈrico. La lepra presenta un amplio espectro de manifestaciones clÌnicas en consonancia con las lesiones anatomopatolÛgicas y los mecanismos inmunitarios implicados. AsÌ, en un extremo est· la lepra tuberculoide (LT) con lesiones localizadas y un n˙mero escaso de bacilos demostrables, y en el otro polo estarÌa la forma avanzada y progresiva de lepra lepromatosa (LL) con manifestaciones m·s generalizadas, abundantes bacilos y ausencia de inmunidad celular que controle la infecciÛn. Entre ambas formas existen m˙ltiples estadÌos intermedios. La transmisiÛn de la infecciÛn contin˙a siendo desconocida, aunque el 50% de los casos tienen una historia de contacto Ìntimo y prolongado con una persona enferma que probablemente se haya contagiado a travÈs de aerosoles (gotitas nasales) o de las lesiones cut·neas. Otras vÌas de transmisiÛn podrÌan ser el contacto con el suelo infectado y la intervenciÛn de insectos vectores. M. leprae es un bacilo intracelular obligado, indistinguible microscÛpicamente de otras micobacterias, que posee en la c·psula externa gran
cantidad de un glucolÌpido fenÛlico (PGL-1) especÌfico, con cierto valor en las pruebas serolÛgicas. En general el diagnÛstico de la lepra se basa en los hallazgos clÌnicos y la detecciÛn de bacilos ·cido-alcohol resistentes en el material tomado de las lesiones cut·neas o del lÛbulo de la oreja, ya que esta micobacteria, a diferencia del resto, no se puede cultivar in vitro en los medios habituales. La detecciÛn de anticuerpos IgM frente a PGL-1 tiene cierta utilidad en los pacientes con LL no tratada ya que est·n presentes en el 95% de los casos. Sin embargo, sÛlo en el 60% de los pacientes con lepra tuberculoide son valorables, que es la forma con mayores problemas diagnÛsticos clÌnicos e histolÛgicos, ya que presenta un n˙mero bajÌsimo de bacilos en los tejidos. Adem·s, hay que recordar que en zonas endÈmicas estos anticuerpos se pueden detectar en personas clÌnicamente sanas. Por otro lado, la prueba intradÈrmica de la lepromina (extracto de bacilos muertos) tampoco es de utilidad diagnÛstica. M·s recientemente, la introducciÛn de la PCR (reacciÛn en cadena de la polimerasa) para la detecciÛn e identificaciÛn de M. leprae , ha demostrado su rentabilidad en muestras dÈrmicas en las formas lepromatosas, mientras que su sensibilidad es tan sÛlo de un 50% en las formas tuberculoides.
3.3. MNT DE CRECIMIENTO LENTO 3.3.1. Complejo Mycobacterium avium. Este complejo tambiÈn denominado M. avium-intracellulare (CMA) se define como cocobacilos ·cido-alcohol resistentes no tuberculosos de crecimiento lento a 37∫C (10-21 dÌas en medios de rutina), que producen unas colonias pequeÒas, lisas transl˙cidas u opacas no cromÛgenas, y que son patÛgenos oportunistas capaces de producir enfermedad en animales (aves y cerdos) y en el hombre. No obstante, existen variantes morfolÛgicas con rugosidad colonial y cepas que producen un pigmento amarillento. Este complejo est· constituido por M. avium , M. intracellulare y un tercer grupo dentro del cual se ha caracterizado recientemente la especie Mycobacterium chimaera, ( Mycobacterium especie X) miembro a˙n no bien caracterizado. Dentro de M. avium se reconocen cuatro subespecies: subsp. avium, subsp. paratuberculosis, subsp. silvaticum y subsp. hominissuis. Ante la imposibilidad de distinguir las especies con las pruebas bioquÌmicas habituales se recurriÛ a la agrupaciÛn y denominaciÛn de complejo M. avium - M. intracellulare. La heterogeneidad del grupo queda patente ya en los primeros trabajos de serotipado. Mediante hibridaciÛn con sondas de ADN se conoce que, de los 28 serotipos descritos, los serotipos 1-6, 8-11 y 21 corresponden a M. avium y los tipos 7, 12-20 y 22-28 son de M. intracellulare. Actualmente estas especies pueden identificarse y diferenciarse f·cilmente mediante tÈcnicas cromatogr·ficas y, sobre todo, genÈticas. Gracias a
ello, cada vez se conoce m·s sobre las diferencias particulares entre estas especies respecto a la epidemiologÌa, patogenia y clÌnica. AsÌ por ejemplo, mediante sondas de ADN se ha observado que hasta el 98% de los aislamientos de CMA procedentes de pacientes con SIDA eran M. avium , mientras que el 40% de los aislados de este complejo en pacientes sin SIDA eran M. intracellulare. En consecuencia, la denominaciÛn, identificaciÛn y valoraciÛn microbiolÛgica del complejo, como en las dem·s micobacterias, deberÌa realizarse siempre al nivel de especie. A diferencia de M. tuberculosis , cuyo reservorio y fuente de contagio es el hombre, estos microorganismos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza. De hecho, CMA ha sido aislado en el agua, suelo, plantas y animales. Hasta 1981, y debido a la baja patogenicidad de estas bacterias, las enfermedades producidas por CMA fueron escasas y localizadas, especialmente en los pulmones. Posteriormente, con la pandemia del SIDA, estos microorganismos se convirtieron en las infecciones por MNT m·s frecuentes, pudiendo afectar de forma diseminada o focal (pulmones, tracto gastrointestinal o ganglios linf·ticos). En la actualidad, con la introducciÛn en 1996 de la terapia antirretroviral de alta eficacia en los pacientes infectados por el VIH, se ha constatado una disminuciÛn espectacular de las infecciones por CMA. El diagnÛstico de enfermedad en las formas localizadas, como en el resto de MNT, suele ser algo m·s complicado que en la tuberculosis. El aislamiento de estas bacterias en muestras respiratorias o digestivas por ejemplo, puede indicar tan sÛlo una colonizaciÛn. Por tanto, para establecer el diagnÛstico de enfermedad deberÌan aplicarse los criterios de la ATS ( American Thoracic Society ). 3.3.2. Mycobacterium genavense. En1991 se aislÛ este microorganismo en la sangre de un paciente con SIDA en Ginebra (Suiza). La especie se describiÛ en 1993 y fue, hasta la llegada de la terapia antirretroviral de alta eficacia, la segunda MNT m·s aislada tras CMA en pacientes con SIDA. Al igual que Èsta, suele producir infecciones generalizadas en pacientes inmunodeprimidos, aunque tambiÈn se han descrito infecciones entÈricas, genitales y de tejidos blandos. MicrobiolÛgicamente es una especie cocobacilar y no cromÛgena muy similar al complejo M. avium. Sin embargo M. genavense crece mal en medios sÛlidos convencionales. A pesar de haberse logrado crecimientos tras largos periodos de incubaciÛn (1- meses) con agar 7H11 de Middlebrook suplementado con micobactina J, carbÛn activado o sangre, la mayorÌa de los aislamientos suelen recuperarse ˙nicamente en medios lÌquidos, sobre todo cuando estos son acidificados (pH= 6,2). 3.3.3. Mycobacterium haemophilum. El primer aislamiento de M. haemophilum se realizÛ en 1978 a partir de una lesiÛn subcut·nea en un paciente con
3.3.8. Mycobacterium szulgai. Esta micobacteria, descrita en 1972, tiene la peculiaridad de ser escotocromÛgena cuando crece a 37∫C y fotocromÛgena a 25∫C. Por otro lado, aunque fenotÌpicamente se parece a M. gordonae o M. scrofulaceum , mediante secuenciaciÛn del 16S rRNA se asemeja a M. malmoense. Normalmente, M. szulgai s uele ser un aislamiento poco frecuente que puede producir una infecciÛn pulmonar similar a la tuberculosis o infecciones extrapulmonares como la bursitis, tenosinovitis, enfermedades cut·neas localizadas y osteomielitis. 3.3.9. Mycobacterium ulcerans. Aunque se describiÛ en 1948, hasta hace pocos aÒos no se le ha dado la importancia que realmente tiene. Ello se debe a que esta micobacteria no cromÛgena es difÌcil de cultivar, ya que precisa una incubaciÛn muy larga (6 a 12 semanas) y a baja temperatura (30∫C). Adem·s, algunos pretratamientos pueden ser nocivos para su posterior recuperaciÛn. En la actualidad produce una de las infecciones micobacterianas m·s frecuentes tras tuberculosis y lepra: la ˙lcera de Buruli o Bairnsdale dependiendo que sea en ¡frica o Australia. Esta enfermedad, que tambiÈn se ha detectado en AmÈrica del Sur y Nueva Guinea, consiste en un nÛdulo localizado que puede evolucionar ulcer·ndose y produciendo grandes lesiones destructivas, o bien puede producir lesiones m·s profundas como la osteomielitis. Todo ello puede conducir, con frecuencia, a importantes deformidades en las extremidades. El mecanismo exacto de transmisiÛn se desconoce. No obstante, al ser una micobacteria ambiental relacionada con zonas h˙medas y aguas estancadas, la transmisiÛn podrÌa ocurrir por vÌa directa en la piel erosionada o con la participaciÛn de insectos acu·ticos. 3.3.10. Mycobacterium xenopi. Se trata de una micobacteria escotocromÛgena que se aislÛ en 1957 en un sapo de ¡frica ( Xenopus laevis ) y que posee capacidad patÛgena (pulmonar y ganglionar), aunque cerca del 90% de los aislamientos clÌnicos son sÛlo colonizadores o contaminantes. MicroscÛpicamente aparecen como bacilos largos y finos que en medios, fundamentalmente lÌquidos se asocian y forman los caracterÌsticos ìnidos de p·jarosî. Esta especie es de crecimiento muy lento y tiene una temperatura Ûptima de incubaciÛn de 42-45∫C. Esta propiedad, adem·s de ayudar en la identificaciÛn, explica la capacidad de estos microorganismos para desarrollarse en los tanques y depÛsitos de agua caliente de los hospitales, y los m˙ltiples brotes de infecciÛn nosocomial a los que han dado lugar.
3.4. MNT DE CRECIMIENTO R¡PIDO (MCR) Hasta hace unos aÒos, M. fortuitum y M. chelonae constituÌan los dos ˙nicos complejos o grupos de micobacterias de crecimiento r·pido con cierta relevancia clÌnica. Posteriormente se han subdividido
en nuevas especies con diferentes implicaciones patogÈnicas y de sensibilidad a los antimicrobianos. Es de destacar la importancia que pueden tener estas especies en patologÌa nosocomial, la resistencia que muestran a los antituberculosos habituales y la necesidad, por tanto, de emplear para su tratamiento otros antibiÛticos utilizados m·s com˙nmente en la pr·ctica clÌnica habitual. 3.4.1. Mycobacterium abscessus. Es una micobacteria no cromÛgena de desarrollo muy r·pido en medios convencionales y que ha estado asociada durante aÒos a M. chelonae bajo la denominaciÛn de complejo M. fortuitum o M. fortuitum-chelonae. En la actualidad se puede diferenciar f·cilmente por la utilizaciÛn del citrato, el patrÛn de sensibilidad a los antimicrobianos y, sobre todo, mediante la PCR-RFLP del gen hsp65 , entre otras tÈcnicas moleculares_._ Es un microorganismo ubicuo en la naturaleza que puede aislarse de diferentes h·bitat acu·ticos y del suelo, pudiendo contaminar los suministros de agua, reactivos y soluciones de lavado de los hospitales. Ello es debido a su capacidad para sobrevivir en ausencia de nutrientes y en un amplio margen de temperaturas. Suelen causar infecciones pulmonares crÛnicas y tambiÈn, infecciones de heridas quir˙rgicas o tras inyecciones, infecciÛn asociada a catÈteres, a dispositivos de hemodi·lisis, etc., asÌ como infecciones diseminadas en pacientes inmunodeprimidos. 3.4.2. Mycobacterium chelonae. Esta especie fue aislada por primera vez en una tortuga ( Chelona corticata). En la actualidad, M. chelonae es una de las MNT de crecimiento r·pido patÛgenas que muestran una mayor resistencia a los antimicrobianos y que se aÌsla con m·s frecuencia en pacientes inmunodeprimidos. A diferencia de M. abscessus la afectaciÛn pulmonar crÛnica es rara. El cuadro clÌnico m·s frecuente es la enfermedad cut·nea, a veces diseminada, fundamentalmente en pacientes con tratamiento inmunosupresor por trasplantes de Ûrgano sÛlido, artritis reumatoide u otros procesos autoinmunes. Adem·s, M. chelonae puede causar infecciones localizadas postraum·ticas (celulitis, abscesos y osteomielitis). TambiÈn, aunque en menor proporciÛn que M. abscessus y M. fortuitum, puede estar implicado en infecciones de piel y partes blandas, de heridas quir˙rgicas, incluidas las inyecciones, asÌ como las relacionadas con catÈteres intravasculares. 3.4.3. Mycobacterium fortuitum. Mycobacterium ranae fue la denominaciÛn inicial de esta especie al describirse por primera vez en 1905 en ranas. Posteriormente se le dio el nombre actual al aislarse, en 1938, en unos abscesos subcut·neos tras unas inyecciones de vitaminas. Cl·sicamente, en el grupo M. fortuitum , se han incluido tres taxones: M. fortuitum , M. peregrinum y M. fortuitum biovariedad 3, hoy en dÌa considerados especies diferentes. Recientemente a esta ˙ltima se le ha denominado M. porcinum. M. fortuitum puede causar, de forma espor·dica,
infecciones de heridas quir˙rgicas y traum·ticas, osteomielitis, celulitis y, entre otras, las relacionadas con catÈteres intravasculares. Las infecciones pulmonares y diseminadas son infrecuentes. 3.4.4. Mycobacterium peregrinum. Anteriormente considerada una biovariedad de M. fortuitum. De momento, no se conoce el significado clÌnico real de esta bacteria, sin embargo, en un pequeÒo n˙mero de casos se ha notificado que esta especie ha sido el agente causal de infecciones espor·dicas en pulmÛn y heridas de localizaciÛn esternal y cut·neas. Se ha observado que se trata de una especie m·s sensible a los antimicrobianos que M. fortuitum. 3.4.5. Mycobacterium mucogenicum y otras micobacterias no pigmentadas de crecimiento rápido. M. mucogenicum debe su nombre al aspecto mucoide de sus colonias. Aunque se ha recuperado con cierta frecuencia en agua de consumo humano y en esputos, constituyendo una simple contaminaciÛn, se ha notificado su capacidad patÛgena al asociarse con diversos brotes nosocomiales en pacientes sometidos a di·lisis, asÌ como infecciones relacionadas con catÈteres intravasculares y heridas postraum·ticas. En los ˙ltimos aÒos se han descrito numerosas especies de micobacterias no pigmentadas de crecimiento r·pido con implicaciones en patologÌa humana: M. mucogenicum , M. senegalense , M. mageritense , M. septicum , M. houstonense, M. bonickei, M. brisbanense, M. neworleansense, M. alvei, M. brumae, M. canariasense, M. goodi y M. wolynskii. Muchas de ellas se han descrito a partir de variantes de especies ya conocidas como M. smegmatis o M. porcinum. En ellas se han observado algunas diferencias en la sensibilidad antimicrobiana y, especialmente, genÈticas que permiten la caracterizaciÛn de las mismas.
3.5. OTRAS MNT Algunas MNT de crecimiento lento se aÌslan con cierta frecuencia en los laboratorios de microbiologÌa pero suelen ser meros contaminantes. Entre ellas se encuentran M. gordonae y el complejo M. terrae , que se compone de: M. terrae, M. nonchromogenicum y M. triviale. En la ˙ltima dÈcada, con la introducciÛn de los mÈtodos genÈticos de identificaciÛn, se han ido describiendo nuevas especies que, a pesar del reducido n˙mero de cepas notificadas hasta la fecha, muchas de ellas parecen tener cierta relevancia clÌnica (tabla 2).
4. MUESTRAS: SELECCIÓN, RECOGIDA, TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN Las muestras remitidas al laboratorio deben cumplir una serie de condiciones generales de las que depende la calidad y eficiencia de los resultados microbiolÛgicos: indicaciÛn correcta del estudio de micobacterias,
selecciÛn de la muestra m·s representativa y rentable, recogida de forma estÈril en cantidad suficiente y si es posible antes del inicio del tratamiento antimicobacteriano. No deben utilizarse fijadores ni sustancias conservantes. Tampoco es recomendable emplear escobillones, hisopos o torundas de algodÛn. Las muestras se deben recoger y enviar en contenedores estÈriles, de un solo uso y con cierre hermÈtico. El procesamiento de la muestra debe ser inmediato para evitar el sobrecrecimiento de la microbiota acompaÒante; de lo contrario, debe guardarse en frigorÌfico (2-8oC) hasta dicho momento, salvo los hemocultivos que deben conservarse en estufa o bien a temperatura ambiente. En la actualidad no se recomiendan las recolecciones de 24 horas por la posible diluciÛn de las muestras con una mayor concentraciÛn bacilar y el aumento de la contaminaciÛn bacteriana y f˙ngica.
4.1. SELECCI”N DE LA(S) MUESTRA(S). Depender· en gran medida de la sintomatologÌa del paciente y de su enfermedad de base, asÌ como del centro sanitario e infraestructura disponible. Como regla general se intentar· obtener las muestras m·s sencillas y con mÈtodos no invasores. En principio, cualquier tipo de muestra puede enviarse para su estudio micobacteriolÛgico. Sin embargo, la gran mayorÌa ser·n de origen respiratorio ya que las patologÌas m·s frecuentes ocurren en esta localizaciÛn anatÛmica. Aunque el cultivo de muestras respiratorias es fundamental para el diagnÛstico de la tuberculosis , su utilizaciÛn, al igual que el de las muestras digestivas (heces) para determinadas especies micobacterianas, como es el complejo M. avium , es mucho m·s controvertido, al poder tratarse tan sÛlo de una colonizaciÛn. Por ello, sin sospecha clÌnica, no es recomendable el cultivo rutinario e indiscriminado de heces y de muestras respiratorias en pacientes VIH seropositivos. Especial menciÛn precisa la sospecha de infecciÛn diseminada por micobacterias. Esta requerir· el cultivo de muestras de territorios estÈriles. La sangre es la mejor muestra para su detecciÛn. El n˙mero de hemocultivos requerido para el diagnÛstico es un tema a˙n en debate. Un solo hemocultivo tiene una sensibilidad del 90-95%. No obstante, parece razonable repetir el cultivo tras 1 Û 2 semanas si persiste la sospecha clÌnica de infecciÛn diseminada. Tras la sangre, la mÈdula Ûsea es la muestra de mayor rendimiento. Su obtenciÛn para otros posibles diagnÛsticos debe acompaÒarse siempre de la b˙squeda de micobacterias. Los laboratorios que no puedan procesar estas muestras pueden optar por enviarlas a su centro de referencia o bien, alternativamente tomar muestras de biopsias de ganglios linf·ticos, bazo e hÌgado, fundamentalmente.
El esputo simple o espont·neo es la muestra m·s frecuente y rentable. Debe recogerse por las maÒanas, cuando existe una mayor concentraciÛn bacilar y en ayunas. Son suficientes tres muestras de 5-10 ml, recogidas en dÌas consecutivos. En caso de no conseguir una expectoraciÛn espont·nea ser· necesario inducir el esputo mediante ìclapingî o nebulizaciones con soluciones salinas. En estos casos, la obtenciÛn del esputo habr· que realizarla en habitaciones bien ventiladas o espacios abiertos donde pueda realizarse un cierto aislamiento respiratorio de los enfermos. Es importante que se informe al laboratorio del tipo de esputo enviado, ya que los inducidos tienden a ser m·s acuosos. Aunque el esputo hemoptoico pueda ser clÌnicamente orientativo, la sangre del mismo puede interferir el rendimiento diagnÛstico. No obstante, cuando no se disponga de otro, Èste se debe procesar. De las muestras obtenidas por técnicas broncoscópicas (broncoaspirado, lavado broncoalveolar y cepillado bronquial con catÈter telescopado) se deben enviar al menos 5 ml para su estudio, teniendo en cuenta que deben procesarse lo antes posible ya que la lidocaÌna, anestÈsico utilizado frecuentemente en la broncoscopia, inhibe el crecimiento de estas bacterias. Respecto a las biopsias respiratorias , tanto las bronquiales como las transbronquiales, pulmonares, pleurales y otras, se precisa un mÌnimo de 1 g de tejido. El jugo gástrico es una buena muestra indicada fundamentalmente en niÒos o adultos en los que no es posible la obtenciÛn de un esputo adecuado y como alternativa a las muestras broncoscÛpicas. La aspiraciÛn g·strica se realizar· a primera hora de la maÒana, cuando todavÌa no ha comenzado el peristaltismo intestinal que eliminarÌa r·pidamente los bacilos micobacterianos deglutidos durante la noche. Adem·s, debido a la acidez del jugo g·strico, se requiere un envÌo y procesamiento r·pido. En caso de no llevarse a cabo en las 4 horas siguientes a su recogida es conveniente neutralizarlo (ej., 100 mg de carbonato sÛdico).
4.3. SANGRE. Se recomienda inocularla en los medios de cultivo de los nuevos sistemas autom·ticos no radiomÈtricos o bien utilizar tÈcnicas de lisis-centrifugaciÛn ( Isolator system ). Aunque el medio 13A del sistema radiomÈtrico BACTEC 460 ha demostrado una gran rentabilidad, este va a dejar de estar disponible en un futuro prÛximo. Si la sangre precisa ser transportada antes de su cultivo debe anticoagularse mediante polianetolsulfonato sÛdico (SPS) o heparina, pero no con EDTA. Con el sistema Isolator la muestra puede permanecer sin procesarse varios dÌas, aunque es recomendable no exceder las 24 horas.
Siempre debe recogerse el mayor volumen posible ( a 15 ml), debido al bajo n˙mero de bacilos presente. Como algunos lÌquidos (ej., articulares) contienen una elevada cantidad de fibrinÛgeno, este tipo de muestras deberÌan recogerse en un tubo con anticoagulante.
4.5. TEJIDOS (BIOPSIAS). Para evitar la deshidrataciÛn de las muestras de biopsia, Èstas deben enviarse al laboratorio en suero fisiolÛgico o bien, en medio lÌquido 7H9 de Middlebrook. Nunca debe utilizarse formol ya que harÌa inviables a las micobacterias. Por ello, se debe distinguir claramente entre las muestras enviadas al laboratorio de anatomÌa patolÛgica y al de microbiologÌa. Las muestras de mÈdula Ûsea se obtendr·n y procesar·n como si de un hemocultivo se tratara.
4.6. ORINA. Se debe recoger la muestra a primera hora de la maÒana obtenida por micciÛn espont·nea, sonda urinaria o punciÛn suprap˙bica, siguiendo las mismas precauciones que en la obtenciÛn de cualquier urocultivo. Es aconsejable recoger tres muestras (mÌnimo de 40 ml) durante tres dÌas consecutivos.
4.7. HECES. Se recomienda el estudio de tres muestras de al menos 1 g cada una. Su procesamiento deberÌa ser inmediato. Para ello se aÒaden 5 ml de medio lÌquido 7H9 de Middlebrook o suero fisiolÛgico a la muestra antes de iniciar la digestiÛn-descontaminaciÛn pertinente.
5. MICROSCOPIA A pesar de que en los ˙ltimos aÒos la micobacteriologÌa ha experimentado importantes avances tecnolÛgicos, el diagnÛstico precoz de infecciÛn por micobacterias y, especialmente de tuberculosis, sigue recayendo en el ex·men microscÛpico de las muestras clÌnicas teÒidas de manera adecuada. En la actualidad, es el procedimiento m·s simple, barato y r·pido en proporcionar al clÌnico una orientaciÛn diagnÛstica preliminar. El ex·men microscÛpico permite valorar la calidad de las muestras recibidas, identificar los pacientes m·s contagiosos, y adem·s resulta ˙til para monitorizar la respuesta de los pacientes al tratamiento antimicobacteriano. En general, la microsocopÌa, por sus caracterÌsticas, debe aplicarse sistem·ticamente sobre cualquier muestra clÌnica en la que sea preciso descartar estos patÛgenos, con la excepciÛn, tal vez, de la sangre. Sin embargo, una tinciÛn negativa no descarta una posible infecciÛn micobacteriana subyacente.
Las micobacterias son microorganismos difÌciles de teÒir con los colorantes b·sicos habituales. Esto se debe a alto contenido de lÌpidos de su pared celular, en especial ·cidos grasos de cadena larga (·cidos micÛlicos). Para lograr la penetraciÛn del colorante primario al interior de la micobacteria se debe recurrir al calor o a determinados detergentes seg˙n el mÈtodo utilizado. Una vez dentro, el colorante no podr· ser extraÌdo tras la exposiciÛn al alcohol-·cido o ·cidos minerales. Esta propiedad se denomina ·cido-alcohol resistencia (AAR) y es ˙til para la visualizaciÛn de este grupo especÌfico de bacterias. Se desconoce la naturaleza exacta del mecanismo de AAR aunque se piensa que el fenol permite la penetraciÛn del colorante, que se ve facilitada por el efecto del calor. Adem·s, las micobacterias son capaces de formar complejos estables con ciertos colorantes arilmetanos como la fucsina o la auramina O. Los mÈtodos m·s utilizados para determinar la AAR de las micobacterias son: a) Las tinciones basadas en la utilizaciÛn de fucsina fenicada (carbolfucsina) como colorante primario. Estas son, la cl·sica de Ziehl- Neelsen o variantes como la de Kinyoun, donde los microorganismos se tiÒen de rojo sobre un fondo azul o verde, dependiendo del contracolorante utilizado. La variante de Kinyoun o coloraciÛn frÌa, emplea cuerpos tensoactivos sin necesidad de calentar el colorante; y b) MÈtodos que utilizan como colorante primario determinados fluorocromos (auramina O, auramina- rodamina) donde los microorganismos que son AAR, bajo la luz ultravioleta, aparecen fluorescentes de color amarillo o naranja dependiendo del filtro empleado. La diferencia b·sica entre ambos mÈtodos radica en el aumento microscÛpico requerido y por tanto el n˙mero de campos a visualizar. De esta forma, los mÈtodos con carbolfucsina precisan el ex·men con un ocular- objetivo de inmersiÛn de gran aumento (x 1.000). En cambio, las tÈcnicas fluorescentes requieren menos esfuerzo al poder observar la preparaciÛn con un ocular-objetivo de menor aumento (x 250) sin pÈrdida de sensibilidad. Ello permite una mayor rapidez de lectura y un menor cansancio del microscopista, siendo por tanto el mÈtodo de cribado recomendado en los laboratorios con un gran n˙mero de muestras. No obstante, cuando exista la menor duda con las tÈcnicas fluorescentes se deber· confirmar mediante una tinciÛn de Ziehl-Neelsen.
5.2. SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD. La microscopÌa presenta una sensibilidad inferior al cultivo, oscilando entre un 22% y un 80%. Existen diversos factores condicionantes que intervienen en la misma: a) Tipo de muestra. Las de origen respiratorio son las de mayor rentabilidad, seguidas de las muestras tisulares; b) La cantidad de muestra procesada; c) La concentración de bacterias en la muestra. Para que una tinciÛn sea positiva debe
contener 10^5 bacterias por ml de muestra. AsÌ, en los lÌquidos de territorios estÈriles, que suelen tener un n˙mero bajo de microorganismos, la microscopÌa es muy poco rentable. Por ello, algunos autores recomiendan en este tipo de muestras llevar a cabo tÈcnicas de concentraciÛn. Aunque la centrifugaciÛn parece la primera opciÛn plausible, no es totalmente eficaz debido a que la densidad de flotaciÛn de las micobacterias est· prÛxima a 1, lo que hace que muchas de ellas permanezcan en el sobrenadante. Sin embargo, si parecen eficaces la superposiciÛn secuencial en un portaobjetos de varias gotas del fluido corporal no centrifugado o la filtraciÛn mediante una membrana de policarbonato; d) El tipo de tinción realizado. Es conocido que la tinciÛn de Kinyoun es la que ofrece una menor rentabilidad, mientras que la tinciÛn con fluorocromos, adem·s de requerir un menor tiempo de observaciÛn, siempre se la ha considerado el de mayor sensibilidad. No obstante, en la actualidad este ˙ltimo aspecto es bastante controvertido y no parece que en sensibilidad supere a la tinciÛn de Ziehl- Neelsen; e) La especie micobacteriana presente. Las micobacterias no tuberculosas se detectan con menor frecuencia y con mayor dificultad que M. tuberculosis. Adem·s determinadas especies, como algunas de crecimiento r·pido, no suelen teÒirse adecuadamente con los fluorocromos. Por ello, en estas micobacterias se recomienda la tinciÛn con carbolfucsina y una decoloraciÛn m·s suave; y f) La experiencia del observador. Aunque la especificidad del examen directo de la muestra para determinar el gÈnero Mycobacterium es bastante elevada, la diferenciaciÛn de la especie a partir de la muestra clÌnica suele ser muy difÌcil. Por otro lado, no hay que olvidar que existen otros microorganismos que pueden presentar diferentes grados de AAR como son: Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella, Gordona, Legionella micdadei y los ooquistes de Cryptosporidium, Isospora, Sarcocystis y Cyclospora.
5.3. OBSERVACI”N MICROSC”PICA. Cada preparaciÛn deber· examinarse exhaustivamente para descartar la presencia de microorganismos AAR. Cuando la muestra se haya teÒido con carbolfucsina deber· examinarse un mÌnimo de 300 campos con el ocular-objetivo de inmersiÛn (x 1.000) antes de emitir un informe negativo. Cuando se haya utilizado una tinciÛn con fluorocromo el examen se har· con un microscopio de fluorescencia y a menor aumento (x 250). Al ampliar el campo visual ser· necesario observar menos campos (al menos 30) para informar la preparaciÛn como negativa. En las extensiones de muestras positivas, los microorganismos pueden tener diferentes formas y tamaÒos. AsÌ, el cl·sico M. tuberculosis aparece como bacilos ·cido-alcohol resistentes (BAAR) de 1 a 10 μm de largo y 0,2 a 0,6 μm de ancho. Estos pueden ser
El elevado contenido lipÌdico de la pared de micobacteriana le confiere una mayor resistencia a los ·cidos y bases fuertes que pueden ser utilizados como agentes descontaminantes de la flora acompaÒante. En principio, un procedimiento de descontaminaciÛn deberÌa ser capaz de eliminar los contaminantes en la medida de lo posible sin afectar gravemente la viabilidad de las micobacterias. Sin embargo, todos los mÈtodos actuales son tÛxicos en alg˙n grado para las mismas. Por otro lado, la digestiÛn permite la homogeneizaciÛn de la muestra ya que algunas, en particular los esputos, contienen moco que si no se lic˙a proporciona a las bacterias contaminantes una barrera de protecciÛn frente a la acciÛn de los agentes descontaminantes. La digestiÛn-descontaminaciÛn sÛlo tiene sentido cuando se piensa que la muestra clÌnica est· contaminada, por lo tanto los lÌquidos org·nicos estÈriles y los tejidos recogidos asÈpticamente no la precisan. Si existen dudas en cuanto a la necesidad de descontaminar o no, podrÌa optarse por refrigerar la muestra 24 h hasta disponer del resultado preliminar de los cultivos bacteriolÛgicos rutinarios de la misma. Existen numerosos protocolos de descontaminaciÛn: mÈtodo de Petroff (hidrÛxido sÛdico), Kubica-Krasnow (cisteÌna y cloruro de benzalconio) y Tacquet y Tison (hidrÛxido sÛdico y laurilsulfato de sodio) entre otros. Algunos de ellos utilizan un mismo reactivo para digerir y descontaminar. Por desgracia, no existe un mÈtodo ideal que sirva para todas las muestras clÌnicas, medios de cultivo y tÈcnicas diagnÛsticas utilizadas. El hidrÛxido sÛdico es el agente descontaminante m·s empleado que posee, adem·s, propiedades mucolÌticas. Al tratarse de un ·lcali muy potente resulta crÌtica la concentraciÛn empleada, asÌ como el tiempo de actuaciÛn. Una descontaminaciÛn agresiva matar· del orden del 20 al 90% de las micobacterias presentes en una muestra clÌnica. La N-acetil-L-cisteÌna es la sustancia mucolÌtica que m·s se utiliza. A pesar de que no tiene efecto inhibitorio directo sobre las bacterias, permite trabajar con concentraciones de hidrÛxido sÛdico m·s bajas cuando se utilizan de forma conjunta. La combinaciÛn N-acetil-L-cisteÌna m·s NaOH al 2% es el mÈtodo de descontaminaciÛn-digestiÛn m·s difundido y el recomendado para la mayorÌa de los sistemas de cultivo autom·ticos con medios lÌquidos. Para lograr el m·ximo rendimiento en la recuperaciÛn de micobacterias, se deberÌan tener presentes las limitaciones de los diferentes mÈtodos de descontaminaciÛn usados. AsÌ, algunas sustancias interfieren negativamente con algunos medios de cultivo. Un ejemplo es la combinaciÛn de laurilsulfato de sodio con NaOH que interfiere con el medio MGIT ( Mycobacterial Growth Indicator Tube ). Otros agentes descontaminantes impiden el crecimiento de determinadas micobacterias, como es el caso del
hidrÛxido sÛdico, el ·cido ox·lico y en menor medida el ·cido clorhÌdrico, que tienen un efecto deletÈreo sobre M. ulcerans. Cuando en un laboratorio se realicen simult·neamente tÈcnicas de amplificaciÛn genÛmica a partir muestras pretratadas, conviene cerciorarse de que ninguna de las sustancias empleadas en el procedimiento de descontaminaciÛn-digestiÛn interfiera con la reacciÛn de amplificaciÛn. En general cada laboratorio deber· utilizar el mÈtodo de digestiÛn-descontaminaciÛn que mejor se adapte a sus necesidades y en consonancia con los sistemas de cultivo e identificaciÛn (tabla 4). Para optimizar y controlar el procedimiento utilizado se deber· analizar con una determinada periodicidad el n˙mero de cultivos contaminados. Aunque cl·sicamente el ideal recomendado se encuentra entre el 3-5% se debe tener en cuenta el tipo de muestra y el o los medios de cultivo utilizados, entre otros factores. En la pr·ctica diaria estos m·rgenes deberÌan ser ˙nicamente orientativos. Cuando existe un n˙mero elevado de contaminaciones en relaciÛn con el pretratamiento de las muestras se pueden adoptar diversas estrategias: a) Incrementar la concentraciÛn del descontaminante. Ello debe realizarse progresivamente y teniendo en cuenta que concentraciones del 4% de hidrÛxido sÛdico elimina, en poco tiempo, la mayorÌa de las micobacterias, b) UtilizaciÛn simult·nea de medios selectivos que inhiban el crecimiento de contaminantes potenciales (bacterias u hongos), c) Verificar la completa digestiÛn de las muestras. En caso contrario incrementar la concentraciÛn de N-acetil-L-cisteÌna en las muestras con excesivo moco, d) En las muestras problem·ticas, se puede optar por procedimientos alternativos de descontaminaciÛn-digestiÛn. Por ejemplo, las muestras procedentes de pacientes con fibrosis quÌstica suelen presentar Pseudomonas. Ello puede combatirse aÒadiendo ·cido ox·lico al 5% al sedimento concentrado tras la descontaminaciÛn- digestiÛn con N-acetil-L-cisteÌna y NaOH.
7. CULTIVO El aislamiento de micobacterias a partir del cultivo de muestras clÌnicas contin˙a siendo fundamental para el diagnÛstico especÌfico de las infecciones por estos microorganismos. El cultivo ha demostrado ser m·s sensible (10 1 -10^2 bacterias viables/ml) que el examen microscÛpico. Adem·s, el aislamiento del agente causal permite la identificaciÛn de la especie, los posteriores estudios de sensibilidad frente a los antimicrobianos, asÌ como la monitorizaciÛn del tratamiento y curaciÛn del paciente. Las micobacterias suelen ser bastante exigentes y requirieren medios ricos y frescos. Existen medios selectivos con diversos antibiÛticos para prevenir el crecimiento de la flora bacteriana o f˙ngica acompaÒante.
Tabla 4. MÈtodos de digestiÛn y descontaminaciÛn de las muestras clÌnicas. Método Agente(s) Comentarios Kubica N-acetil-L-cisteÌna (NALC) e hidrÛxido sÛdico (NaOH) al 2%
DescontaminaciÛn suave. La concentraciÛn de NaOH puede aumentarse al 3% en caso de un exceso de contaminaciÛn. La NALC debe prepararse diariamente. LÌmite de exposiciÛn al NaOH de 15 min. Es el mÈtodo m·s difundido, especialmente en EE UU. Tacquet y Tison Laurilsulfato sÛdico al 3% y NaOH al 1%
DescontaminaciÛn suave. Aconsejable cultivar en medios con huevo para neutralizar los restos del detergente. Algunos autores describen su superioridad respecto al NALC-NaOH. Por el contrario, parece ser incompatible con el BACTEC y los sistemas autom·ticos de cultivo no radiomÈtricos. MÈtodo bastante utilizado en Europa. Petroff NaOH al 4% DescontaminaciÛn agresiva con efecto homogeneizante a dicha concentraciÛn. Requiere control riguroso del tiempo de exposiciÛn (≤15 min). Karlson Fosfato trisÛdico al 13% y cloruro de benzalconio (Zefiran)
Ideal en laboratorios que no pueden controlar el tiempo de exposiciÛn. Precisa sembrarse en medios con huevo o neutralizar el Zefiran con lecitina. No debe emplearse con los sistemas autom·ticos y puede resultar lesivo para el complejo M. avium (CMA). Lˆwenstein-Sumiyoshi Acido sulf˙rico al 4-5% ⁄til en muestras que sÛlo precisen descontaminaciÛn. Pr·ctico en laboratorios con gran volumen de orinas. Corper y Uyei Acido ox·lico al 5% El m·s efectivo en muestras contaminadas con Pseudomonas y en la recuperaciÛn de CMA a partir de heces. Smithwick Cloruro de cetil-piridinio al 1% y ClNa al 2%
DescontaminaciÛn suave. ⁄til para el transporte de muestras. Requiere un mÌnimo de 24 h de exposiciÛn. Debe sembrarse en medios con huevo o previa neutralizaciÛn del amonio cuaternario.
Aunque los medios no selectivos no contienen antibiÛticos, poseen algunas sustancias inhibidoras para el control de bacterias contaminantes, como son los colorantes de anilina (verde de malaquita o cristal violeta). Su concentraciÛn suele ser crucial para mantener el equilibrio entre la recuperaciÛn micobacteriana deseada y la posible contaminaciÛn a partir de las muestras de territorios no estÈriles. Si la concentraciÛn es muy elevada puede llegar a afectar seriamente el crecimiento micobacteriano. En general, para el aislamiento primario a partir de muestras clÌnicas se prefieren medios no selectivos , líquidos y, a ser posible, la combinaciÛn de uno líquido y uno sólido.
Se pueden dividir en dos grupos b·sicos: medios con huevo o con agar. 7.1.1. Medios sólidos con huevo. Son medios ricos que contienen huevo (entero o sÛlo yema), fÈcula de
patata, sales, glicerol y un agente inhibidor como es el verde de malaquita. Las ventajas fundamentales radican en la buena recuperaciÛn de gran parte de las especies micobacterianas y su buena capacidad tanto, inhibidora de la flora contaminante, como tamponante que permite neutralizar m˙ltiples productos tÛxicos presentes en las muestras clÌnicas, asÌ como algunos restos de diversos productos descontaminantes. Adem·s, poseen una vida media prolongada cuando se conservan a 2-8 ∫C ( meses) y las pruebas fenotÌpicas de identificaciÛn, realizadas a partir de subcultivos provienen de estos medios, son bastante fidedignas. Sin embargo, son medios difÌciles de preparar (coagulaciÛn a 85-95 ∫C) lo que conlleva algunas variaciones de un lote a otro. Esto puede influir en la concentraciÛn final de los antimicrobianos en las pruebas de sensibilidad in vitro. TambiÈn presentan, a veces, algunos problemas para distinguir entre los restos del inÛculo y el crecimiento micobacteriano. Por ˙ltimo, cuando se contaminan se afecta todo el medio pudiendo llegar a licuarse.
autom·tico de cultivo y detecciÛn MGIT 960. Asimismo, puede utilizarse para las pruebas de sensibilidad de M. tuberculosis a los antimicobacterianos de primera lÌnea. 7.3.2. Sistemas de detección automática o semiautomática. La introducciÛn del BACTEC 460 TB en la dÈcada de los ochenta revolucionÛ el cultivo de estos microorganismos, mejorando la recuperaciÛn de todo tipo de micobacterias y disminuyendo considerablemente el tiempo de detecciÛn de las mismas. A pesar de ser el patrÛn de referencia desde entonces, sus problemas, sobre todo, derivados de la utilizaciÛn de isÛtopos radiactivos, han llevado al desarrollo de nuevos sistemas automatizados no radiomÈtricos como son: ESP II System, MB/BacT ALERT 3D y MGIT 960. Aunque estos sistemas presentan un mayor n˙mero de contaminaciones, la rentabilidad global obtenida hasta la fecha es comparable al sistema radiomÈtrico. Adem·s de no utilizar isÛtopos radiactivos, presentan otras importantes ventajas como son: la automatizaciÛn, la sencillez y la desapariciÛn de la posible contaminaciÛn cruzada al tener mÈtodos de detecciÛn que no implican una manipulaciÛn del contenido de los tubos. 7.3.2.1. Sistema BACTEC 460TB. Es un sistema semiautom·tico de cultivo y detecciÛn del crecimiento micobacteriano para todo tipo de muestras, incluidas las hem·ticas. Utiliza el medio lÌquido 7H12 de Middlebrook que es un caldo base de 7H9 de Middlebrook que contiene ·cido palmÌtico marcado con (^14) C. Tras ser metabolizado el substrato por la bacteria,
libera 14 CO 2 a la fase aÈrea que se mide por el aparato y cuyo Ìndice refleja la cantidad de microorganismo existente en el medio. Este mÈtodo puede utilizarse tambiÈn para la identificaciÛn presuntiva (utilizando p- nitro-amino-hidroxipiofenona -NAP) y pruebas de sensibilidad. No obstante, aunque sigue siendo ˙til, especialmente para las pruebas de sensibilidad, presenta las desventajas de, sobre todo, utilizar isÛtopos radiactivos (^14 C), no estar automatizado, contaminaciÛn cruzada potencial, posible producciÛn de aerosoles durante la manipulaciÛn y lectura, y tener un precio elevado. En la actualidad esta siendo sustituido por los sistemas automatizados no radiomÈtricos que se detallan a continuaciÛn. 7.3.2.2. Sistema ESP Culture System II. Es un sistema autom·tico no radiomÈtrico de monitorizaciÛn continua, para la detecciÛn y determinaciÛn de la sensibilidad de micobacterias. El medio base consta de un 7H9 de Middlebrook con suplementos antibiÛticos y de enriquecimiento y unas esponjas de celulosa incluidas en el medio para ofrecer un h·bitat natural y mayor superficie de cultivo. La detecciÛn se realiza mediante sensores de presiÛn que detectan el consumo de oxÌgeno. El sistema efect˙a lecturas cada dos horas generando un gr·fico para cada cultivo y a travÈs de un sistema experto determina si el cultivo es positivo o negativo. Tiene capacidad para 1920 cultivos
simult·neos. Admite cualquier mÈtodo cl·sico de descontaminaciÛn y puede utilizarse para todo tipo de muestras, incluyendo sangre y mÈdula Ûsea. Las pruebas de sensibilidad est·n disponibles para tres f·rmacos: isoniacida, rifampicina y etambutol. 7.3.2.3. Sistema MB/BacT ALERT 3D. Sistema automatizado de cultivo colorimÈtrico que detecta la producciÛn de CO 2 como indicador de crecimiento bacteriano. El medio utilizado es el b·sico 7H9 de Middlebrook suplementado con factores de crecimiento y una soluciÛn antibiÛtica para las muestras de origen no estÈril. Con una monitorizaciÛn continua, los cultivos permanecen en el incubador-lector sin un manejo adicional hasta que el equipo notifica su positividad o bien su negatividad tras el periodo de incubaciÛn fijado. La capacidad de cultivo es variable y muy vers·til ya que permite la adiciÛn de m˙ltiples armarios incubadores de 240 cultivos cada uno. Otra ventaja es que puede utilizarse, al igual que el ESP Culture System II, con todo tipo de nuestras, incluidas las sanguÌneas. A diferencia de este sÛlo admite el mÈtodo de descontaminaciÛn de la NaOH-NALC (N-acetil-L-cisteÌna). Recientemente se han empezado a realizar las pruebas de sensibilidad en M. tuberculosis a los antimicobacterianos de primera lÌnea, sin incluir la pirazinamida. La aplicaciÛn de estas pruebas en la rutina de los laboratorios clÌnicos se encuentra en evaluaciÛn. 7.3.2.4. Sistema BACTEC MGIT 960. Es el ˙ltimo sistema automatizado que ha aparecido en el mercado. Este sistema utiliza el medio MGIT, detectando consumo de O 2 mediante unos sensores fluoromÈtricos. Un aspecto relevante de este medio (MGIT) es que los tubos poseen tapones de rosca, evitando el uso de agujas y jeringuillas. Los resultados se proporcionan como positivo o negativo y en unidades de crecimiento. B·sicamente, es un sistema de gran capacidad ( cultivos) diseÒado para laboratorios con un gran volumen de muestras (8.000 por aÒo aprox.). Este mÈtodo no puede utilizarse en muestras hem·ticas y, al igual que el MB/BacT ALERT 3D, sÛlo admite el mÈtodo de descontaminaciÛn de NaOH-NALC (N-acetil-L-cisteÌna). Recientemente, se ha introducido para la realizaciÛn de las pruebas de sensibilidad de M. tuberculosis a los antimicobacterianos de primera lÌnea, incluida la pirazinamida. Aunque ha sido aprobado por la FDA ( Food and Drug Administration ) y los datos iniciales son muy prometedores, la utilizaciÛn sistem·tica de estas pruebas en los laboratorios de MicrobiologÌa est· en proceso de consolidaciÛn y consenso general. 7.3.2.5. Sistema BACTEC serie 9000. Se trata de un sistema automatizado de hemocultivos convencionales que, mediante un software y un medio de cultivo especÌfico, puede utilizarse para la recuperaciÛn de micobacterias en muestras hem·ticas. Es un sistema colorimÈtrico con una capacidad de 50 a 240 cultivos que complementarÌa el MGIT 960.
La mayorÌa de las especies tienen un buen crecimiento a 35-37∫C. No obstante, en algunas muestras clÌnicas (piel y tejidos blandos) donde pueden intervenir especies ( M. marinum , M. chelonae, M. haemphilum, M. ulcerans, etc.) cuya temperatura de incubaciÛn Ûptima es menor, se deber·n sembrar e incubar un grupo adicional de cultivos entre 25 y 33∫C. En la actualidad, ello es factible en los cultivos de lectura manual. Un aspecto importante para mejorar el crecimiento en los medios sÛlidos es la incubaciÛn con un 5-10% de CO 2 que, en el caso del Lˆwenstein-Jensen, puede reducirse a los primeros 7-10 dÌas tras la siembra, incubando despuÈs en una estufa convencional. Como regla general, el tiempo de incubaciÛn debe ser prolongado. Aunque no hay un acuerdo un·nime, el periodo de 6-8 semanas parece ser el m·s adecuado. Ante la sospecha de una micobacteria de crecimiento muy lento, muestras sanguÌneas o aquellas con una baciloscopia o amplificaciÛn genÈtica positiva, se podrÌa alargar la incubaciÛn 4 semanas m·s. La lectura de los cultivos manuales se adaptar· a las necesidades y posibilidades de cada laboratorio. Una recomendaciÛn general serÌa una lectura a los 3-5 dÌas de la siembra y posteriormente, 2 veces a la semana durante las 4 primeras semanas, seguida de una lectura semanal hasta el final de la incubaciÛn.
8. IDENTIFICACIÓN 8.1. IDENTIFICACI”N FENOTÕPICA A lo largo de los ˙ltimos aÒos, el n˙mero de especies nuevas de micobacterias ha aumentado de forma muy importante, principalmente gracias al desarrollo de las tÈcnicas basadas en la biologÌa molecular. Sin embargo, y a pesar de la creciente implantaciÛn de estas tÈcnicas en los laboratorios asistenciales, gran parte de ellos contin˙an usando, en mayor o menor medida, diversas caracterÌsticas fenotÌpicas para la caracterizaciÛn de los aislamientos. 8.1.1. Microscopía. Como se ha comentado, una caracterÌstica com˙n de todo el gÈnero Mycobacterium es su ·cido-alcohol resistencia. Este hecho es importante para confirmar que el crecimiento observado en el cultivo es una micobacteria y detectar una posible contaminaciÛn. Aunque otros organismos pueden exhibir dicha ·cido-alcohol resistencia, esta es parcial a diferencia de las micobacterias que son capaces de resistir una decoloraciÛn fuerte. Adem·s, como se ha descrito con anterioridad (secciÛn 5), dentro del gÈnero existen diferencias microscÛpicas que pueden orientar de forma presuntiva la identificaciÛn de alguna especie. 8.1.2. Velocidad de crecimiento. Ello nos permite hacer una primera divisiÛn de las micobacterias en dos grandes grupos: micobacterias de crecimiento lento y de crecimiento r·pido. Esto se basa en los dÌas de incubaciÛn que un subcultivo sÛlido (ej., 7H10 de Middlebrook) necesita para la detecciÛn de colonias
visibles macroscÛpicamente. Un punto crÌtico es la diluciÛn del inÛculo utilizada en dicho subcultivo. Las micobacterias que tarden m·s o menos de 7 dÌas ser·n catalogadas como lentas o r·pidas, respectivamente. Sin embargo, existen algunas especies cuya velocidad de crecimiento se encuentra en un grupo intermedio que, en alg˙n caso, puede ser modificable en funciÛn de otras variables, como la temperatura de incubaciÛn (ej., M. marinum ). Dicha clasificaciÛn es muy importante, puesto que los planteamientos diagnÛsticos van a cambiar dependiendo de que el aislamiento pertenezca a un grupo u otro. 8.1.3. Temperatura de crecimiento. Es una caracterÌstica que permite tanto la recuperaciÛn de determinadas especies como su identificaciÛn presuntiva. En general la temperatura Ûptima de crecimiento suele ser de 37∫C. No obstante, existen especies que precisan temperaturas m·s bajas (30∫C), en especial las aisladas en piel y tejidos blandos ( M. marinum, M. ulcerans, M. haemophilum ). Otras, en cambio, requieren temperaturas m·s elevadas de 42∫C ( M. xenopi ) o incluso 52∫C ( M. thermoresistibile ) para obtener una tasa de crecimiento mejor. 8.1.4. Características de las colonias 8.1.4.1. Producción de pigmento. Se basa en la capacidad de producir pigmentos carotenoides en relaciÛn con la exposiciÛn a la luz: fotocromÛgenas si la producciÛn depende de la luz o escotocromÛgenas si es independiente de la misma. Adem·s estarÌan las especies que no producen pigmentos o micobacterias no cromÛgenas. Este aspecto permitiÛ clasificar las micobacterias en los ya cl·sicos grupos de Runyon (tabla 1). 8.1.4.2. Morfología de las colonias. Tanto en medios con base de huevo o de agar. En manos expertas, todas estas caracterÌsticas permiten al microbiÛlogo orientar hacia la identificaciÛn de la especie con un elevado grado de fiabilidad, especialmente si se tiene en cuenta que, las micobacterias de interÈs clÌnico m·s frecuentes son un grupo reducido dentro del total de especies del gÈnero. AsÌ, la apariciÛn de colonias rugosas no pigmentadas de crecimiento lento y aspecto de migas de pan suele ser caracterÌstica de M. tuberculosis , mientras que las colonias pequeÒas, lisas y no pigmentadas son caracterÌsticas del complejo M. avium. En cambio las colonias grandes, lisas, mucosas, de crecimiento lento pero fotocromÛgenas serÌan m·s tÌpicas de M. kansasii. Una aproximaciÛn distinta es la que estudia las características microscópicas de las colonias en medios con agar, donde se pueden observar las estructuras caracterÌsticas de las cuerdas o cordones (propias de M. tuberculosis ) incluso antes de que puedan detectarse colonias visibles macroscÛpicamente. 8.1.5. Pruebas bioquímicas. El n˙mero de estas pruebas ha llegado a ser amplÌsimo, lo que ha dado lugar a no pocos problemas de interpretaciÛn de las
