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analisis cuantitativo de microorganismos en agua
Tipo: Apuntes
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Introducción Las pruebas bioquímicas son una serie de procedimientos que se realizan con el fin de identificar características metabólicas especificas que a su vez nos permite identificar el genero y especie de una bacteria, esto es de vital importancia ya que la mayoría de las enfermedades con las que se enfrenta el ser humano son de origen microbiano y al identificar que bacteria es la causante de la patología presente se tiene la información de como atacarla y erradicar la infeccíon. Streptococcus pneumoniae Coloniza la nasofaringe humana y puede diseminarse en circunstancias especiales hacia sitios anatómicos contiguos como pulmones, senos paranasales u oído medio. Adicionalmente puede ser transportado vía sanguínea provocando sepsis y meningitis en niños y adultos. la colonización de la mucosa requiere de adhesinas específicas y mecanismos de evasión de la respuesta inmune como la cápsula y la proteasa de IgA. La cápsula representa su principal factor de virulencia ya que cepas carentes de ella no son virulentas. Impide la acción del complemento sobre la bacteria evitando el depósito de C3b por lo que se requiere de la presencia de anticuerpos tipo específico (del serotipo capsular correspondiente) para que se realice la opsonofagocitosis. Klebsiella pneumoniae Este género está formado por cinco especies (K. ornithinolytica K. oxytoca, K. planticola. K. terrigena y K. pneumoniae). K. pneumoniae tiene dos subespecies: K. pneumoniae subsp. ozaene y K. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis. Los miembros de este género se disponen en pares o en cadenascortas. Presentan una gran cápsula, constituida de polisacáridos, lo que diferencia a este género del resto de las enterobacterias. Las colonias d e K. pneumoniae desarrolladas en agar MacConkey se observan grandes, mucoides y de color rosado porque son lactosa positivas. Cuando las defensas del hospedero están debilitadas o la bacteria sale de su hábitat natural como parte de la microbiota autóctona, producen enfermedad. K. pneumoniae con sus diferentes subespecies han sido referidas como causantes de brotes de infecciones intrahospitalarios o nosocomiales en diferentes partes del mundo. La frecuencia como causantes de infecciones comparada con otros microorganismos, las coloca en primer lugar como causa de bacteriemias, en segundo lugar, en infecciones por venopunción y de las vías urinarias y en tercer lugar en infecciones de heridas expuestas como es el caso de quemaduras.
Caldo rm-vp (rojo de metilo / voges-proskauer) Prueba - Rojo de Metilo Prueba de Voges-Proskauer (IMViC) Gelatina Nutritiva Prueba - licuefacción de la gelatina Efectuar las observaciones correspondientes e interpretar resultados. Si la reacción es negativa, continúe incubando durante otros tres días y agregue un poco más de rojo de metilo. Después de la incubación agregar 5 gotas de indicador rojo de metilo. Después de la incubación agregar 5 gotas de indicador rojo de metilo. Incubar el tubo a 35 °C durante 48-72 horas mínimo (se recomienda incubar a una temperatura de 30 °C por 3-5 días). Inocular por difusión el caldo RM- VP con el microorganismo indicado por el asesor. La inoculación debe hacerse con un inóculo liviano. Efectuar las observaciones correspondientes e interpretar resultados. Deje reposar el tubo durante 10-15 antes de intentar la interpretación de color. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno atmosférico a fin de oxidar la acetoína y obtener una reacción de color. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno atmosférico a fin de oxidar la acetoína y obtener una reacción de color. Agregue 0.2 mL de la solución de KOH al 40%. Inocular por difusión el caldo RM- VP con el microorganismo indicado por el asesor. La inoculación debe hacerse con un inóculo liviano. Incubar el tubo a 35 °C durante 24- horas. Después de la incubación agregar 0.6 mL de la solución de α-Naftol al 5%. Efectuar las observaciones correspondientes e interpretar resultados. En caso de una prueba negativa incube hasta las 72 horas y repita el procedimiento. Inocular por punción el medio con el microorganismo indicado por el asesor. La inoculación debe hacerse con un inóculo denso. Coloque los tubos en el refrigerador por 30 minutos y observe. Incubar el tubo a 35 °C durante 24- horas.
Medio O/F Glucosa de Hugh y Leifson Prueba - oxidación-fermentación Medio MIO Prueba - movilidad Medio SIM Prueba - producción de ácido sulfhídrico (H 2 S) Efectuar las observaciones correspondientes e interpretar resultados. Incubar el tubo a 35 °C durante 48 horas (esta prueba puede necesitar 3-4 días o incluso hasta 14 días de incubación). Inocular por punción el medio con el microorganismo indicado por el asesor. La inoculación debe hacerse con un inóculo poco denso. Inocular por punción el medio con el microorganismo indicado por el asesor. Efectuar las observaciones correspondientes e interpretar resultados. Incubar el tubo a 35 °C durante 24-48 horas. Al finalizar el periodo, añadir 5 gotas del reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. En caso de utilizar el reactivo de Ehrlich este paso debe ser precedido por la adición de 1 mL de cloroformo. Al finalizar el periodo, añadir 5 gotas del reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. En caso de utilizar el reactivo de Ehrlich este paso debe ser precedido por la adición de 1 mL de cloroformo. Incubar el tubo a 35 °C durante 24-48 horas. Inocular por punción el medio con el microorganismo indicado por Efectuar las observaciones correspondientes e interpretar resultados.
Agar de Fenilalanina Prueba - fenilalanina desaminasa Agar Almidón Prueba – almidón. Efectuar las observaciones correspondientes e interpretar resultados. Incubar los tubos a 35 °C durante 18-24 horas. Inocular el medio en pico de flauta con el microorganismo indicado por el profesor. La inoculación debe hacerse con un inóculo denso. Agregar 4-5 gotas del reactivo de FeCl3 al tubo incubado, rotar el reactivo con suavidad sobre el pico de flauta. Una reacción positiva ocurre en 1 minuto. Interpretar la reacción de inmediato ya que el color es inestable y se aclara con rapidez. Efectuar las observaciones correspondientes e interpretar resultados. Inocular la placa con el microorganismo indicado por el profesor por estría cerrada. Invertir las cajas e incubar a 35 °C durante 24-48 horas. Después de la incubación cubrir la placa con solución de Lugol.
Resultados CEPA 1 Medio de cultivo
Tabla de características coloniales. Parámetros Agar sangre Agar Mac Conkey Tamaño < 5 mm --- Forma Puntiforme --- Borde Entero --- Color Grisáceo ---
IV. Catalasa: Esta prueba nos ayuda a identificar la presencia de la enzima “catalasa” que es una enzima que actúa degradando el peróxido de hidrogeno H 2 O 2 que es un agente altamente oxidante y puede ser perjudicial para la bacteria, este es convertido en agua y oxigeno molecular que es liberado al ambiente. En este caso, se reporta un resultado negativo a la prueba, lo que nos indica que la bacteria carece de la enzima, tal como nos lo indica la literatura, que señala que la enzima catalasa está presente en la mayoría de las bacterias aerobias facultativas con la excepción principal de las bacterias del género Streptococcus. V. Optoquina: Esta prueba nos permite determinar la sensibilidad de un microorganismo a la sustancia química “optoquina” misma que prueba la fragilidad de la membrana celular bacteriana, este ensayo es especifico para diferenciar al Streptococcus pneumoniae de otras especies de Streptococcus α- hemolíticos ya que son especialmente sensibles a ella. En este caso, se reporta un halo de inhibición por encima de los 16 mm, razón por la cual se reporta que el microorganismo es sensible a esta especie química. Esto ultimo nos permite decir que el sujeto de estudio es un Streptococcus pneumoniae. VI. Bacitracina: Esta prueba nos permite evaluar si el microorganismo en estudio es sensible al antibiótico “bacitracina” que es un antibiótico peptídico que actúa inhibiendo la síntesis de pared bacteriana. Esta prueba también permite diferenciar al Streptococcus pneumoniae del Streptococcus pyogenes ya que este ultimo es sensible a la bacitracina mientras que el Streptococcus pneumoniae es resistente. En este caso se reporta una resistencia al antibiótico lo que evidencia la presencia del Streptococcus pneumoniae. VII. Solubilidad en bilis: El objetivo de esta prueba es probar la capacidad de las células bacterianas de sufrir un proceso de lisis en presencia de sales biliares, esta prueba es utilizada específicamente para diferenciar entre Streptococcus pneumoniae que es soluble en bilis y otras especies de Streptococcus α- hemolíticos que no lo son. En este caso se reporta un resultado positivo lo que señala la presencia de Streptococcus pneumoniae esta es la misma razón por la que no se presentó crecimiento en el agar MacConkey_._ VIII. Prueba CAMP: La finalidad de este experimento es determinar la capacidad de un microorganismo para producir el factor CAMP que actúa en conjunto con la β-hemolisina estafilocócica sobre los eritrocitos produciendo una β-hemolisis. Esta prueba arroja un resultado negativo ya que como se observó al analizar la placa de agar, se presentó una hemolisis α y no una β que es la que produce este factor CAMP en conjunto con la β-hemolisina.
Cepa 2 - Cultivo Medio de cultivo – Agar sangre El crecimiento de esta cepa en el agar sangre, presenta dos características destacadas que nos dan información importante para su identificación, la consistencia mucoide es característica de un cultivo de bacterias que poseen capsula que es un factor que le confiere una importante virulencia a la célula ya que la protege de la fagocitosis y le permite adherirse de mejor manera a su hospedero. La otra característica destacada del crecimiento es la presencia de γ-hemolisis que señala que el microorganismo no es capaz de realizar una lisis sobre los eritrocitos y por lo tanto no se presenta ningún cambio en el medio de cultivo. Medio de cultivo – Agar MacConkey Este agar, es un medio de cultivo ligeramente selectivo ya que permite el crecimiento de microrganismos gram negativos al contrario de los gram positivos que no crecen en este medio por su contenido en sales biliares. Este cultivo presenta tres características que nos brindan información para si diferenciación, la primera es que las colonias presentan una coloración rosa que nos indica que se trata de un microorganismo con la capacidad de fermentar lactosa lo que también causa la segunda característica importante que es la ausencia de cambio de color del medio ya que el proceso de fermentación produce acidos orgánicos, lo que causa que el medio se acidifique y se mantenga el color rojo del indicador ya que este es color rojo en condiciones ácidas y amarillo en condiciones alcalinas. Por último, las colonias presentan una consistencia mucosa que es una característica que sugiere que las células cultivadas poseen capsula; eso se confirmara con la tinción de rojo Congo al observar la preparación al microscopio. Su capacidad de fermentar lactosa nos hace inclinarnos hacia la familia de las Enterobacteriaceae. Cepa 2 – Pruebas bioquímicas I. Tinción Gram: En la tinción de gram se pueden observar células en forma de cocobacilos de color rosa, color que nos indica que pertenece al grupo de los gram negativos lo que nos indica que posee una delgada capa de peptidoglicano contrario a las gram positivas que poseen una gruesa capa de esta sustancia. El peptidoglicano tiene una alta afinidad por el colorante cristal violeta, por lo que las bacterias gram positivas (con una gruesa capa de peptidoglicano) se teñirán de color violeta y las gram negativas no será capaces de retener este colorante, pero si podrán captar la safranina que les dará un color rosa. También se observa una morfología de cocobacilos y aunado a su capacidad para fermentar lactosa que nos indica que posiblemente pertenezca a la familia Enterobacteriaceae se puede deducir
medio de desarrollo basal, con producción de gas o sin ella, junto con la determinación de la posible producción de H 2 S. Esta prueba cumple tres funciones en general, determina si el microorganismo es capaz de fermentar glucosa, si es capaz de fermentar lactosa y si produce H 2 S, el resultado de la fermentación de la glucosa se puede observar en el fondo del tubo, mientras que la fermentación de la lactosa se puede observar en el pico de flauta, ambas zonas sufrirán un vire independiente de la otra; la producción de H 2 S se vera con un ennegrecimiento del fondo del medio y se reportará la producción de gas. En este estudio, se reporta un pico de flauta amarillo, lo que indica que se encuentra en condiciones ácidas, un fondo amarillo que india lo mismo y una ausencia de el ennegrecimiento del medio por lo que se reporta un resultado negativo para la producción de H 2 S, resultados que son propios de Klebsiella pneumoniae. VIII. MIO: El medio MIO se utiliza para definir tres características del metabolismo bacteriano, mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar el aminoácido ornitina para formar una amina, con la consiguiente alcalinidad. La evaluación de la producción del indol es una prueba que evaluar la capacidad de algunas bacterias para oxidar el aminoácido triptófano, teniendo como metabolitos principales el indol, escatol e indolacético. Finalmente se evalúa si el microorganismo posee movilidad, las bacterias tienen la capacidad de moverse por medio de sus flagelos, esta característica se evidencia por una ligera turbidez junto a la picadura del inoculo. En este caso se reporta un resultado negativo para la descarboxilación de la ornitina, lo que se evidencia con la presencia de un color amarillo en el fondo del tubo; la producción del indol también reporta un resultado negativo que se denota por que no se produce color en la superficie del medio y de igual manera, la prueba de movilidad reporta un resultado negativo ya que no se observa ninguna turbidez fuera de la punción de inoculo. El indicador que se usa en esta prueba es el purpura de bromocresol que es de color morado en condiciones alcalinas y amarillo en condiciones ácidas. Los productos de degradación de la ornitina y del triptófano son metabolitos alcalinos, por lo que en caso de que se den, el pH del medio subirá y nos dará el color violeta y rojo en la superficie dando un resultado positivo. IX. Lisina descarboxilasa: Esta prueba nos sirve par determinar la capacidad de una bacteria de descarboxilar el aminoácido lisina para formar una amina con la resultante de alcalinidad. Esta prueba nos sirve para la diferenciación de las sub especies Klebsiella pneumoniae subesp. Rhinoscleromatis que arroja un resultado negativo a esta prueba y Klebsiella pneumoniae subesp pneumoniae que arroja un resultado positivo. En esta prueba se usa el indicador purpura de bromocresol para evidenciar la presencia de condiciones alcalinas producto de la descarboxilación de la lisina. El resultado de esta bacteria es positivo
evidenciado por un vire del medio a color violeta, por lo que es una evidencia más de la bacteria Klebsiella pneumoniae. X. RF/Lactosa: La prueba roja de fenol se utiliza para evaluar la capacidad de un microorganismo para usar un carbohidrato específico para producir energía, es este caso el carbohidrato a evaluar es la lactosa que nos arroja un resultado positivo, mismo resultado que ya había sido evidenciado por las colonias rosas presentes en el agar MacConkey. Para esta prueba se usa el indicador rojo de fenol que en condiciones básicas es rojo y en condiciones ácidas es amarillo. Las condiciones ácidas se producen después de la fermentación del carbohidrato que se le agrega al medio ya que un metabolito final de la fermentación de carbohidratos es un ácido orgánico, esto es lo que ocasiona el vire del medio de rojo a amarillo. XI. RF/Glucosa: La prueba roja de fenol se utiliza para evaluar la capacidad de un microorganismo para usar un carbohidrato específico para producir energía, es este caso el carbohidrato a evaluar es la glucosa que nos arroja un resultado positivo que se evidencia por un vire del medio de rojo a amarillo por lo anteriormente explicado en la prueba de lactosa. La mayoría de las bacterias de la familia Enterobacteriaceae son capaces de fermentar carbohidratos, en este caso, la Klebsiella pneumoniae es parte de esa familia y también es capaz de obtener energía de estos dos últimos carbohidratos fermentándolos. Datos teóricos Klebsiella pneumoniae En los medios de TSI o KIA (agar con hierro de Kligler) desarrollan con producción de ácido en base y pico (ácido/ácido), generalmente con abundante producción de gas que desplaza la columna de medio de cultivo en el tubo y sin SH 2. Klebsiella spp y Enterobacter spp. causan reversión rápida del pico de flauta, en las primeras 24 h de incubación. La mayoría de las especies son indol negativas (a excepción de K. oxytoca , única especie productora de indol), todas son inmóviles, utilizan citrato como única fuente de carbono, fermentan adonitol, manitol, lactosa y sacarosa, desdoblan la urea, descarboxilan la lisina, no utilizan la ornitina (a excepción de R. ornithinolytica ) y utilizan el malonato. Si bien todas fermentan glucosa, algunas cepas de Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae y Klebsiella pneumoniae subsp. rhinoscleromatis lo hacen lentamente. Las pruebas diferenciales entre especies del género Klebsiella se detallan en la siguiente tabla.
Conclusiones Las pruebas bioquímicas son de vital importancia ya que nos permiten conocer características específicas del metabolismo de las bacterias, así como factores de virulencia que nos son significativos a nosotros como especie. El conocer estas características bacterianas nos da información sobre como y/o con que atacar las infecciones ocasionadas con por los diferentes microorganismos con los que a diario tenemos contacto. Con esta práctica se logro conocer de manera general las principales pruebas bioquímicas que se usan para la identificación del género y especie de bacterias de interés medico y/o académico. Se reviso información general de estas dos cepas bacterianas para su identificación y con ello se conoce el método general paso a paso que se utiliza para la diferenciación de bacterias. La principal utilidad que se le da a estas pruebas es en el área clínica, pero de igual manera se puede aplicar en otras áreas como el área industrial en donde se producen fármacos contra estos microorganismos. Bibliografía. Harper, H., Murray, R., Granner, D., Rodwell, V., & Pastrana R, V. (2007). Bioquímica ilustrada [de] Harper (28th ed.). México: Editorial El Manual Moderno. Harvey, R., & Ferrier, D. (2011). Bioquímica (5th ed.). Barcelona: Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins. Gutiérres, C., Escalera, E., Romero, G., & Saucedo, J. et al. (2017). Manual de Laboratorio Microbiología General 1 [Ebook]. Ciudad de México. Bailón, L., Cruz, R., & Cervantes, A. (2003). Atlas de pruebas bioquímicas para identificar bacterias [Ebook] (1st ed.). Ciudad de México: Facultad de Estudios Superiores Zaragoza. Lopardo, H., Predari, S., & Vay, C. (2016). Manual de microbiología clínica de la Asociación Argentina de Microbiología: Enterobacterias [Ebook] (1st ed.). Buenos Aires, Argentina: Asociación Argentina de Microbiología. Mac Faddin, J., Rondinone, S., & Giovanniello, O. (2003). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica (3rd ed.). Buenos Aires: Médica Panamericana. Molina, J., López, R., & Sánchez, J. (2019). Microbiología y parasitología médicas de Tay (5th ed.). Ciudad de México: Méndez Editores, S.A. de C.V.
