Insulina para determinar Elisa | Guías, Proyectos, Investigaciones de Sociología

I. USO PREVISTO

Este kit ELISA de insulina humana se utiliza para la cuantificación no radiactiva de insulina

humana en suero, plasma y otros medios biológicos. Este kit no tiene reactividad cruzada

con la proinsulina humana intacta y su principal intermedio procesado, la desinsulina des

(31,32); sin embargo, puede haber reactividad cruzada con el intermedio menor, des (64,65)

proinsulina, en suero. Un kit es suficiente para medir 38 muestras desconocidas por

duplicado. Este kit es solo para uso en investigación. No debe utilizarse en los

procedimientos de diagnóstico.

II PRINCIPIOS DE PROCEDIMIENTO

Este ensayo se basa en ELISA Sandwich, secuencialmente en: 1) captura de moléculas de

insulina humana de muestras a los pocillos de una placa de microtitulación recubierta por

una cantidad previamente titulada de anticuerpos monoclonales de insulina antihumana de

ratón y la unión de un segundo biotinilado anticuerpo monoclonal de ratón antihumano

contra la insulina capturada, 2) lavado de materiales no unidos de las muestras, 3)

conjugación de peroxidasa de rábano picante a los anticuerpos biotinilados inmovilizados,

4) lavado de conjugados enzimáticos libres y 5) cuantificación de anticuerpos inmovilizados

conjugados enzimáticos mediante el control de las actividades de peroxidasa de rábano

picante en presencia del sustrato 3,3 ', 5,5' tetrametilbencidina. La actividad enzimática se

mide espectrofotométricamente mediante el aumento de la absorbencia a 450 nm después

de la acidificación de los productos formados. Dado que el aumento en la absorbencia es

directamente proporcional a la cantidad de insulina humana capturada en la muestra

desconocida, esta última puede derivarse por interpolación de una curva de referencia

generada en el mismo ensayo con estándares de referencia de concentraciones conocidas

de insulina humana.

III. REACTIVOS SUMINISTRADOS

Cada kit es suficiente para ejecutar una placa de 96 pocillos y contiene los siguientes

reactivos:

A. Placa de ELISA para insulina humana

Recubierto con anticuerpos monoclonales de insulina anti-humanos monoclonales

Cantidad: 1 plato

Preparación: listo para usar

Nota: las tiras no utilizadas deben volverse a sellar en la bolsa de aluminio con el desecante

proporcionado

y almacenado a 2-8 ° C.

B. Sellador de placas adhesivas

Cantidad: 1 hoja

Preparación: listo para usar

C. Concentrado de tampón de lavado 10X HRP

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I. USO PREVISTO

Este kit ELISA de insulina humana se utiliza para la cuantificación no radiactiva de insulina humana en suero, plasma y otros medios biológicos. Este kit no tiene reactividad cruzada con la proinsulina humana intacta y su principal intermedio procesado, la desinsulina des (31,32); sin embargo, puede haber reactividad cruzada con el intermedio menor, des (64,65) proinsulina, en suero. Un kit es suficiente para medir 38 muestras desconocidas por duplicado. Este kit es solo para uso en investigación. No debe utilizarse en los procedimientos de diagnóstico. II PRINCIPIOS DE PROCEDIMIENTO Este ensayo se basa en ELISA Sandwich, secuencialmente en: 1) captura de moléculas de insulina humana de muestras a los pocillos de una placa de microtitulación recubierta por una cantidad previamente titulada de anticuerpos monoclonales de insulina antihumana de ratón y la unión de un segundo biotinilado anticuerpo monoclonal de ratón antihumano contra la insulina capturada, 2) lavado de materiales no unidos de las muestras, 3) conjugación de peroxidasa de rábano picante a los anticuerpos biotinilados inmovilizados,

lavado de conjugados enzimáticos libres y 5) cuantificación de anticuerpos inmovilizados conjugados enzimáticos mediante el control de las actividades de peroxidasa de rábano picante en presencia del sustrato 3,3 ', 5,5' tetrametilbencidina. La actividad enzimática se mide espectrofotométricamente mediante el aumento de la absorbencia a 450 nm después de la acidificación de los productos formados. Dado que el aumento en la absorbencia es directamente proporcional a la cantidad de insulina humana capturada en la muestra desconocida, esta última puede derivarse por interpolación de una curva de referencia generada en el mismo ensayo con estándares de referencia de concentraciones conocidas de insulina humana. III. REACTIVOS SUMINISTRADOS Cada kit es suficiente para ejecutar una placa de 96 pocillos y contiene los siguientes reactivos: A. Placa de ELISA para insulina humana Recubierto con anticuerpos monoclonales de insulina anti-humanos monoclonales Cantidad: 1 plato Preparación: listo para usar Nota: las tiras no utilizadas deben volverse a sellar en la bolsa de aluminio con el desecante proporcionado y almacenado a 2-8 ° C. B. Sellador de placas adhesivas Cantidad: 1 hoja Preparación: listo para usar C. Concentrado de tampón de lavado 10X HRP

Concentrado 10X de solución salina tamponada con Tris 50 mM que contiene Tween- 20 Cantidad: 50 ml / vial Preparación: Diluir 1:10 con agua desionizada. III. REACTIVOS SUMINISTRADOS (continuación) D. Estándares de insulina humana ELISA Insulina humana en tampón: 2, 5 10, 20, 50, 100 y 200 μU / ml Cantidad: 0.5 ml / botella Preparación: listo para usar Nota: Los estándares en este kit han sido calibrados para una referencia internacional estándar, código NIBSC # 66/304. E. Controles de calidad ELISA 1 y 2 Insulina humana recombinante purificada en tampón de ensayo Cantidad: 0.5 ml / botella Preparación: listo para usar F. Solución matricial Suero humano tratado Cantidad: 1 ml / vial Preparación: listo para usar G. Tampón de ensayo PBS 0,05 M, pH 7,4, que contiene EDTA 0,025 M, azida sódica al 0,08% y BSA al 1% Cantidad: 8 ml / vial Preparación: listo para usar H. Anticuerpo de detección de insulina humana Anticuerpo monoclonal de ratón biotinilado pre-titulado con anticuerpo anti-insulina humana Cantidad: 3 ml / vial Preparación: listo para usar I. Solución enzimática Conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante pre-titulado en tampón Cantidad: 12 ml / vial Preparación: listo para usar

Lector de placas de microtitulación capaz de leer la absorbencia a 450 nm
Agitador de placas de microtitulación orbital
Papel o tela absorbente VI. MATERIALES REQUERIDOS, PERO NO SUMINISTRADOS
Pipetas y puntas de pipeta: 10 μL - 20 μL o 20 μL - 100 μL
Pipetas multicanal y puntas de pipeta: 5 ~ 50 μL y 50 ~ 300 μL
Depósitos de tampones y reactivos
Mezclador Vortex
Agua desionizada
Lector de placas de microtitulación capaz de leer la absorbencia a 450 nm
Agitador de placas de microtitulación orbital
Papel o tela absorbente VII. RECOGIDA Y ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS
Para preparar muestras de suero, la sangre completa se extrae directamente en un tubo de suero Vacutainer® que no contiene anticoagulante. Deje que la sangre coagule a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Centrifugue inmediatamente la sangre coagulada a 2,000 a 3,000 x g por 15 minutos a 4 ± 2oC.
Transfiera y almacene muestras de suero en tubos separados. Feche e identifique cada muestra.
Use suero recién preparado o almacene muestras en alícuotas a – 20oC para su uso posterior. Evite los ciclos de congelación / descongelación.
Para preparar muestras de plasma, se debe recolectar sangre completa en tubos de plasma EDTA Vacutainer® y centrifugarla inmediatamente después de la recolección. Observar lo mismo precauciones en la preparación de muestras de suero.
Si la heparina se va a utilizar como anticoagulante, el efecto sobre el resultado del ensayo a la dosis de heparina utilizada se debe predeterminar.
Evite el uso de muestras con hemólisis macroscópica o lipemia. VIII PROCEDIMIENTO DE ENSAYO Precaliente todos los reactivos a temperatura ambiente inmediatamente antes de configurar el ensayo.

Diluya 10 veces el tampón de lavado HRP concentrado 10X mezclando todo el contenido del tampón con 450 ml de agua desionizada o de vidrio destilada.
Retire el número requerido de tiras de la placa de ensayo de microtitulación. Las tiras no utilizadas deben volverse a sellar en la bolsa de aluminio y almacenarse a 2-8 ° C. Ensamble las tiras en un soporte de placa vacío y llene cada pocillo con 300 μl de tampón de lavado HRP diluido. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Decantar el tampón de lavado y eliminar la cantidad residual de todos los pocillos invirtiendo la placa y golpeándola de forma inteligente sobre toallas absorbentes varias veces. No permita que los pozos se sequen antes de continuar con el siguiente paso. Si se utiliza una máquina automatizada para el ensayo, siga las instrucciones del fabricante para todos los pasos de lavado descritos en este protocolo.
Agregue 20 μL de tampón de ensayo a los pocillos NSB (unión no específica) y a cada uno de los pocillos de la muestra (consulte IX para obtener las orientaciones sugeridas).
Si las muestras a analizar son suero o plasma, agregue 20 μL de solución de matriz a los pocillos NSB, estándar y de control. Si las muestras no contienen componentes significativos de la matriz del suero, agregue 20 μL de tampón de ensayo en su lugar.
Agregue duplicados 20 μL de patrones de insulina humana en el orden de concentración ascendente a los pocillos apropiados. VIII PROCEDIMIENTO DE ENSAYO (continuación)
Agregue 20 μL QC1 y 20 μL QC2 a los pocillos apropiados.
Agregue secuencialmente 20 μL de las muestras desconocidas por duplicado a los pocillos restantes.
Agregue 20 μL de anticuerpo de detección a todos los pocillos. Para obtener el mejor resultado, todas las adiciones deben completarse en 30 minutos. Cubra la placa con sellador de placa e incube a temperatura ambiente durante 1 hora en un agitador de placa de microtitulación orbital configurado para rotar a velocidad moderada (aproximadamente 400 a 500 rpm).
Retire el sellador de placa y las soluciones de decantación de la placa. Toque como antes para eliminar las soluciones residuales en los pozos.
Lave los pocillos 3 veces con tampón de lavado HRP diluido, 300 μl por pocillo por lavado. Decantar y golpear después de cada lavado para eliminar el tampón residual.
Agregue 100 μL de solución enzimática a cada pocillo. Cubra la placa con sellador e incube con agitación moderada a temperatura ambiente durante 30 minutos en el agitador de placa de microtitulación.
Retire el sellador, decante las soluciones de la placa y toque la placa para eliminar el líquido residual.
Lave los pocillos 5 veces con tampón de lavado HRP diluido, 300 μl por pocillo por lavado. Decantar y golpear después de cada lavado para eliminar el tampón residual.

A. sensibilidad El nivel más bajo de insulina que se puede detectar con este ensayo es de 1 μU / ml cuando se usa un tamaño de muestra de 20 μL XII CARACTERÍSTICAS DEL ENSAYO (continuación) B. especificidad La especificidad (también conocida como selectividad) de la prueba analítica es su capacidad para medir selectivamente los analitos en presencia de otros componentes similares en la matriz de la muestra. Insulina humana 100% [DE (50) = 0,68 nM] Insulina Porcina 154% Insulina Bovina 56% Insulina Ovina 39% Insulina de rata n.d. * Proinsulina humana n.d. ** Des (64,65) Proinsulina humana 117% Des (31,32) Proinsulina humana 0.3% Proinsulina Porcina <0.1% Proinsulina Bovina <0.1% IGF-I humano n.d. * IGF-II humano n.d. * Glucagón n.d. * Péptido similar al glucagón 1 n.d. ** Péptido C humano n.d. * Péptido C de rata n.d. * Leptina humana n.d. * Leptina de rata n.d. * Mouse Leptin n.d. * n.d .: no detectable a concentraciones de hasta * - 120 nM; y ** - 100 nM. XIV CONTROLES DE CALIDAD Los rangos para el Control de calidad 1 y 2 se proporcionan en el inserto de la tarjeta o se pueden encontrar en el sitio web de EMD Millipore emdmillipore.com utilizando el número de catálogo como palabra clave.

XV GUÍA PARA RESOLVER PROBLEMAS

Para obtener resultados confiables y reproducibles, el operador debe leer cuidadosamente este manual y comprende completamente todos los aspectos de cada paso del ensayo antes intentando ejecutar el ensayo.
Durante todo el ensayo, el operador debe cumplir estrictamente los procedimientos con Buena práctica de laboratorio.
Tenga a mano todos los reactivos y equipos necesarios antes de comenzar. Una vez que el ensayo ha comenzado, todos los pasos deben completarse con precisión sincronización y sin interrupción.
Evite la contaminación cruzada de los reactivos o muestras que se utilizarán en el ensayo.
Asegúrese de agregar todos los reactivos y muestras al fondo de cada pocillo.
La mezcla cuidadosa y completa de soluciones en el pozo es crítica. Pobre ensayo la precisión resultará de una mezcla incompleta o contaminación cruzada del pozo debido a mezcla inadecuada
Elimine las burbujas de aire formadas en el pozo después de la acidificación del sustrato. solución porque las burbujas interfieren con las lecturas espectrofotométricas.
La señal alta en el fondo o en los pozos en blanco podría deberse a 1.) cruzar bien contaminación por solución estándar o muestra o 2.) lavado inadecuado de pozos con tampón de lavado o 3.) sobreexposición a la luz después de que el sustrato ha sido adicional.

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