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TEMA 1. MICROSCOPÍA ÓPTICA
El microscopio es un instrumento básico para el estudio de la Biología, ya que nos permite percibir detalles de organismos y estructuras que no podrían ser observados directamente, por simple inspección ocular.
Para observar elementos tan pequeños es necesario disponer de lentes de aumento. Estas lentes se conocen desde tiempos de Arquímedes, pero la óptica como disciplina se comenzó a desarrollar en el siglo XIII con el monje franciscano Roger Bacon.
ANTONY VAN LEENWENHOEK
En el siglo XVII un comerciante holandés, utilizando microscopios simples de fabricación propia describió por primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos.
Características:
El primitivo microscopio de Leeuwenhoek tenía dos lupas combinadas con las que llegó a alcanzar 260 aumentos, lo cual le permitió visualizar algunos protozoos e infusorios.
ERNST ABBE
Las mejoras más importantes de la óptica surgieron en 1877 cuando Abbe publica su teoría del microscopio.
CALR ZEISS
Mejora la microscopía de inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro lo que permite obtener 2000 aumentos.
MICROSCOPIO
Del griego Mikrós (pequeño) y skopéin (observar)
Los Microscopios son instrumentos de óptica que nos permiten ver objetos muy pequeños o detalles estructurales imposibles de distinguir a simple vista (por debajo del límite de resolución).
La mayoría de las observaciones microscópicas se realizan sobre células muertas que han sido procesadas para:
- Eliminar el agua
- (^) Preservar su estructura
- Dar contraste a sus componentes
- Obtener una sección delgada para que la luz pueda atravesarla
Otras veces se observan células vivas.
PARÁMETROS ÓPTICOS
- Aumento: se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el aumento del ocular.
- Poder de resolución: es la distancia si dos puntos se distinguen. Mayor, cuanto menor es la longitud de onda. Mayor, cuanto más grande es la apertura numérica. Mayor con aceite de cedro.
- Nº de campo: diámetro de la imagen observada a través del ocular, expresada en milímetros.
- Profundidad de foco: capacidad del microscopio para enfocar.
- Contraste: diferencia de absorción de luz entre el objeto y el medio. Puede aumentarse con tinciones.
TIPOS DE MICROSCÓPIOS
Los microscopios nos permiten obtener imágenes de la morfología externa o interna de la célula. Los conocimientos sobre las estructuras celulares y tisulares se han obtenido básicamente con la ayuda de tres instrumentos:
- Microscopio óptico
- Microscopio electrónico de transmisión
- Microscopio electrónico de barrido
Cada uno de ellos nos aporta un tipo de información acerca de la morfología de la célula.
- MICROSCOPIO SIMPLE (LUPA O MICROCOPIO ESTEROSCÓPICO)
Es un aparato de una sola lente o un solo sistema de lentes convergentes biconvexas (parte óptica) sostenidas por un soporte con tornillos de enfoque.
Proporciona una imagen virtual aumentada entre 2 y 20-30 veces. La magnificación depende del aumento proporcionado por los oculares y el sistema de acercamiento (zoom).
Se usan como auxiliares en la observación o disección de piezas anatómicas pequeñas.
2. MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO (CONVENCIONAL, DE CAMPO
CLARO O MICROSCOPIO FOTÓNICO)
- Tornillos de enfoque: permite regular la distancia entre la muestra y los objetivos. Hay dos: macrómetro y micrómetro.
- Soportes para el condensador, diafragma y filtros.
Sistema de soporte o estativo: tubo, brazo, platina y pie.
Parte mecánica que se puede desmontar: cabezal, oculares, estativo, tornillos de la platina, condensador y objetivos.
Sistema de ajuste
Sistema de enfoque
Platina
Palanca de cierre del diafragma
Tornillos del condensador
Tornillo que permite mover el cabezal
Tornillos reguladores de la platina
Anillo de ajuste de los oculares
FrenoTornillo micrométricoTornillo macrométricoPinzaEscalaFiltro
Parte óptica:
- Sistema de iluminación: fuente de luz.
- Suele ser una lámpara halógena de intensidad graduable.
- Se enciende y apaga con un interruptor.
En el exterior puede tener un filtro.
- Lentes: objetivos y oculares, condensador, diafragma.
- Condensador: concentra la luz de la lámpara en un punto de la preparación.
- Diafragma o iris (está dentro del condensador): si se cierra mejora el contraste, pero empeora la resolución.
Objetivos: Suele haber objetivos de distintos aumentos (3.5X, 4X, 5X, 10X y/o 25X,
40X ó 45X y 100X). 100x se suele usar con una gota de aceite de cedro o sustancia con índice de refracción semejante al del vidrio.
Son sistemas de lentes convergentes, corregidos para las aberraciones cromática y esférica.
- Están colocados en el revolver
- Tienen un sistema de amortiguación
- Un anillo coloreado indica los aumentos
- Están recubiertos por un sistema metálico
- En ellos se inscriben todos sus datos
- Oculares:
Es la lente que recoge la imagen dada por el objetivo, a partir de la cual origina una imagen aumentada, virtual y derecha. Está recubierto por un
Interruptor y graduación de la luz
LámparaDiafragma o irisCondensador Rojo 4x Blanco 100x
Amarillo 10x
Azul 40x
- Tras el tercer baño hacemos los bloques con moldes. Ponemos una capa de parafina, introducimos la pieza en el molde, la orientamos y lo cubrimos con parafina. Lo dejamos a temperatura ambiente o en una placa fría. Las piezas duran eternamente. Si vamos a realizar muchas piezas podemos hacerlas con un aparato.
3.Preparaciones histológicas:
- Realización de cortes:
- Microtomo: se utiliza en caso de que hayamos utilizado parafina en vez de congelación. Está formado por un brazo en el que se sitúa la muestra, la inmoviliza. También tiene una cuchilla con la que se hacen los cortes. Tiene otro brazo con el que damos vueltas, por cada vuelta hace un corte (grosor 5-7 micras).
- Criostato: se utiliza se hemos congelado los tejidos ya que el criostato lo mantiene a baja temperatura. Posee una ventana que se abre y dentro hay un brazo, una cuchilla y una manivela. Es igual que el micrótomo pero con baja temperatura (-20- -40 grados) por lo que es mucho más caro. Además si tenemos piezas a -80 grados y las pasamos a -30 grados sufrirán cambios en su estructura y cambiara la configuración de sus proteínas.
4.Estirado de los cortes: se introducen en un baño con agua a alta temperatura.
Para pegar los cortes utilizamos albumina-glicerina (la más habitual porque es la más barata), silano y poli L-lisina para inmunotinción. Los tres sirven para tinciones simples. Lo más cómodo es el silano porque da para 200 o 300 portas.
- Microtomo: para pegar el corte al portaobjetos introducimos el porta en el agua, lo acercamos al corte y lo vamos sacando, el corte se pega. Para secarlas las dejamos escurriendo, secamos la parte de detrás con la bata y luego las dejamos en los bordes del baño para que se sequen del todo con el calor. Secamos porque cuanto más seco este más se pegará.
Los metemos en un sitio de almacenaje y lo introducimos en la estufa a 37º y lo dejamos la noche. Luego los almacenamos en cajas rotuladas para evitar humedad y polvo.
- Criotomo: ponemos sacarosa como pegamento y ponemos a muestra. Hacemos los cortes que van quedando en la cuchilla, no se enrollan, al poner el porta encima de la cuchilla el corte se pega al porta debido a la diferencia de temperaturas (porta caliente, cuchilla fría). Se mantienen congelados, en cestillos.
TINCIONES
Para teñir los cortes que ya están en portas necesitamos quitar la parafina, se quita con xilol, damos año de xilol y luego de alcohol igual que antes y finalmente con agua porque los colorantes se diluyen en agua. Luego aplicamos los colorantes como:
orceína, hematoxilina-eosina y tinciones tricrómicas (con 3 colorantes). Lavamos para quitar el exceso de colorante.
Deshidratación con agua, alcoholes y xilol. Quitamos el agua porque queremos protegerlo con un cubre. Al estar en xilol sacamos la preparación y ponemos el pegamento y el cubre y dejamos secar.
Tinciones de diferentes partes con diferenres colorantes:
- Hematoxilina-eosina: tráquea
- Tricrómico de Masson: esófago de rata
- Método de C. Nissl: neurona
- Para histoquímica: túbulos seminíferos
- Fosfatasa ácida, ATP-asa y NADPH en epidídimo
3.MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO
Condensador especial, diferente al del microscopio compuesto, que dirige los rayos luminosos desde la parte lateral. Las lentes del microscopio sólo reciben la luz dispersada por los diferentes componentes celulares por lo que las estructuras aparecen brillantes sobre un fondo oscuro.
Se utiliza para la observación de células vivas (células en cultivo) y móviles como bacterias y espermatozoides.
Aunque tiene similar límite de resolución que un MO de campo claro, mejora la visualización. Así por ejemplo una célula en cultivo puede mostrar brillantes el nucléolo, envoltura, mitocondrias o gotitas lipídicas.
Permite observar mejor el grosor de la pared celular.
4.MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES
Permite observar células vivas y tejidos sin colorear.
Se usa especialmente para el examen de células vivas.
Se basa en la existencia de pequeñas diferencias en el índice de refracción de diferentes partes de la célula y tejidos. Por ello no es necesario usar tinción.
Adición de un diafragma anular ubicado en el condensador para iluminar el objeto con un cono de luz estrecho.
Por interferencia entre los rayos de luz provenientes de las diferentes regiones del objetivo y aquellos influenciados por el anillo de fase, se logran imágenes diferenciadas que no se podrían ver con un MO normal.
5.MICROSCOPIO DE INTERFERENCIA (DIC)
Permite observar muestras vivas en su medio y realizar un seguimiento del cultivo: viabilidad (vivas o muertas), multiplicación, contaminación.
Control sobre cambios morfológicos (efectos de hormonas, de tratamientos con medicamentos, de iones, interacciones, etc).
8.MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
Los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética emitida por las moléculas que han absorbido la excitación primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda.
Observamos imágenes fluorescentes sobre fondo negro. Permite observar con un solo fluorocromo cada vez.
Se deben colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo. Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas con fluorocromos.
La fluorescencia es la propiedad de una sustancia para emitir luz cuando es expuesta a radiaciones del tipo ultravioleta, rayos catódicos o rayos X
Las radiaciones absorbidas (invisibles al ojo humano), son transformadas en luz visible, o sea, de una longitud de onda mayor a la incidente.
La fluorescencia ocurre cuando un átomo vuelve a su estado fundamental después de haber estado excitado eléctricamente.
Tenemos una sustancia no excitada (nivel inicial), se le aplica radiación y se excita (1). Tras esto se produce un decaimiento (2) pero se mantiene y finalmente vuelve a su estado inicial (3), para ello tiene que emitir una energía en forma de luz, esto es la fluorescencia.
La microscopía de fluorescencia de tejidos, células o estructuras subcelulares es lograda marcando el anticuerpo con un fluorocromo y permitiendo que éste encuentre su antígeno correspondiente presente en la muestra.
Al marcar varios anticuerpos con diferentes fluorocromos se puede lograr la visualización de múltiples objetivos dentro de una misma imagen (doble marcaje).
Se diferencia de otros por su estructura. La fuente de luz está en medio y pasa por unos filtros, mediante un espejo dicrómico cambiamos la dirección de la luz orientándola hacia la preparación. La luz llega a la preparación y esta se excita y emite luz (que es lo que vemos).
APLICACIONES DEL M.D.F.
- Microscopía de fluorescencia
- Microscopía confocal
- Citometría de flujo
- (^) Hibridación in situ
- Inmunohistoquímica
- PCR en tiempo real
9.MICROSCOPIO CONFOCAL
Emplea una técnica óptica de imagen para incrementar el contraste y/o reconstruir imágenes tridimensionales utilizando diferentes elementos para eliminar la luz desenfocada o destellos de la lente en especímenes que son más gruesos que el plano focal y el ruido de fondo.
Combina partes de un MO, al que se adapta un equipo fluorescente con un sistema de barrido en el que se emplea un rayo láser. Mediante un ordenador se registran los datos y se obtiene una sección óptica muy delgada. Pueden lograrse imágenes de la muestra a diferentes profundidades y luego el ordenador reconstruye la imagen.
Incrementa el contraste, permite reconstruir imágenes tridimensionalmente. Permite observar cortes más gruesos porque toma diferentes secciones de las muestras. La imagen es más nítida y más real. Es muy caro y surgió a mediados del siglo XIX.
Puede captar hasta tres fluorocromos diferentes de manera simultánea.
10.MICROSCOPIO DECONVOLUCIÓN
La deconvolución surgió inicialmente como una alternativa más barata a la microscopía confocal, aunque hoy en día se aplica tanto a imágenes adquiridas en los sistemas confocales como en los de fluorescencia convencional.
Un programa informático es capaz de interpretar la información recogida mediante la adquisición de imágenes procedentes de diferentes planos de la preparación (secciones ópticas), eliminando la luz fuera de foco y las aberraciones ópticas de nuestro sistema.
De esta manera se mejora significativamente la calidad de la imagen proporcionando una imagen más limpia y contrastada donde es posible distinguir un mayor número de detalles.
A partir de la información de las secciones ópticas recogidas el programa elimina el ruido y la luz fuera de foco obteniendo imágenes de una calidad muy superior y, en el caso de microscopios convencionales, de calidad similar a la de los confocales.
En ausencia de la información necesaria el programa es capaz de calcular la imagen “teórica” a partir de la información de las secciones ópticas de la muestra.
Para trabajar con estos programas se necesitan ordenadores de gran potencia, ya que requieren un enorme número de cálculos matemáticos que deben correr a velocidades lo suficientemente altas como para poder obtener resultados en un tiempo razonablemente corto. De esta manera los ordenadores suelen disponer de más de un procesador y de un tamaño de memoria bastante elevado.
