¡Descarga Microscopia óptica y más Apuntes en PDF de Biología Celular solo en Docsity!
1: Microscopia òptica Cristina Vázquez Sánchez
Microscopia òptica
= Longitud d’ona de la llum, el nostre espectre visible és entre 400-700nm.
n = Índex de refracció =
𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑡𝑎𝑡 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑙𝑙𝑢𝑚 (𝑚𝑒𝑑𝑖 1) 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑡𝑎𝑡 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑙𝑙𝑢𝑚 (𝑚𝑒𝑑𝑖 2)
sin 𝑎𝑛𝑔𝑙𝑒 𝑑′𝑖𝑛𝑐𝑖𝑑è𝑛𝑐𝑖𝑎 sin 𝑎𝑛𝑔𝑙𝑒 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑓𝑟𝑎𝑐𝑐𝑖ó
Refracción : La luz se tuerce en el agua, cambia el ángulo, en el aire la luz es más rápida que en el agua.
1. Aire, algunos rayos se van por el poder de refracción y hay peor calidad (ángulo más pequeño). 2. Aceite de inmersión, se concentran más rayos y el ángulo va siendo más grande.
μm
1: Microscopia òptica Cristina Vázquez Sánchez
sin = Apertura numérica 0’61 és una constant
D = RESOLUCIÓ Distància mínima a la qual dos objectes independents es veuen separats.
- Com més petita és la longitud d’ona (), més petita serà D, per tant, millor resolució tindrà la imatge.
La resolució màxima d’un MO està entre 0’17 i 0’.
Els augments efectius d’un microscopi són aquest valor multiplicat per 1000.
- A partir d’un número concret d’augments, la resolució baixa.
Microscopi òptic de llum blanca
1: Microscopia òptica Cristina Vázquez Sánchez
A més, hi ha part de la llum que es desvia i no arriba, i amb l’oli d’immersió entre vidre i lent la llum es concentra més.
Les mostres han de seguir tot un procés per poder visualitzar-les al microscopi i que la llum les pugui travessar.
Fixació Inclusió Tall Coloració-tinció
- Fixació amb formaldehid o etanol per la conservació de les cèl·lules
- Inclusió en parafina o resines, per facilitar el tall
- Tall amb micròtom (entre 1-10 micres aprox)
- Tinció
o Normalment amb colorants (tipus hematoxilina&eosina) o Actualment també es pot “tenyir” amb tècniques d’immunocitoquímica, marcant amb Ac que tenen enzims units (peroxidasa habitualment) i reaccionen donant una coloració marronosa. o També es pot marcar amb fluorocroms, immunofluorescència, i els resultats es poden observar amb un microscopi de fluorescència.
Microscopi de contrast de fase
- S’utilitza per veure cèl·lules sense tenyir, normalment és útil per cèl·lules vives (cultius).
- Dins d’una cèl·lula, diferents estructures tenen diferent densitat (per tant, diferent angle de refracció).
o Quan els fotons travessen la mostra, unes zones capturen més fotons i altres menys, i d’aquesta manera es poden distingir lleugerament.
o Els fotons canvien la seva trajectòria Uns són refractats i altres no refractats. El microscopi de CF aprofita aquestes variacions per generar eixos de projecció Imatges de contrast.
o Fa coincidir tots els fotons a la retina alhora.
1: Microscopia òptica Cristina Vázquez Sánchez
(AMPLIACIÓ)
Existen objetos transparentes e incoloros que al ser iluminados no presentan constraste claro oscuro ni de color. Este microscopio permite ver objetos aprovechando las diferencias que existe entre su IR y el medio que los rodea. Esto se consigue al producir un desfase entre la luz que pasa por la muestra y la que pasa por su alrededor.
Este microscopio tiene 2 elementos ópticos:
- DIAFRAGMA ANULAR: Es un diafragma que sólo deja pasar la luz a través de una linea anular. La muestra es iluminada por este cilindro de luz.
- LÁMINA ANULAR O DE FASE: Es una lente anular añadida a las lentes del objetivo que enlentece los haces de luz procedentes del condensador. Esta placa ha de estar alineada con el diafragma.
La luz que llega al objetivo sufre un pequeño enlentecimiento en su recorrido hacia el ocular al atravesar la placa anular.
Incrementa el contraste. La luz que pasa a través de la célula viva sufre un desfase, esta alteración puede hacerse visible aprovechando efectos de interferencia utilizando un microscopio de contraste de fase.
En la muestra hay un desfase, y en el aro hay otro desfase que permite que lo veas. Se utiliza para células no teñidas, para células vivas (cultivos celulares), y de gota colgante (húmedas). Contiene:
- Condensador de fase tiene anillos intercambiables que crean un cono vacío de luz.
- Objetivo de fase con placas correspondientes
o La luz pasa por la muestra y es difractada y refractada cambiando su dirección, y pasa por la zona más amplia de la placa de fase. Al pasar por la zona más amplia de la placa de fase, se produce un desfase mayor de ½ .
o La luz pasa a través de la muestra sin ser difractada ni obstaculizada, y por lo tanto se “cuela” por el anillo de la placa de fase, y al pasar por ese anillo se produce la absorción, disminuye la amplitud. Se produce un desfase de ¼ .
- Resultado final Contraste de intensidad y por las interferencias que se producen con ese desfase.
- Problemas que tiene:
o Crea un artefacto (aureolas luminosas) en los márgenes que hay entre la muestra y el medio, y
entre zonas de diferente densidad óptica. A esto se le llama HALO DE FASE.
1: Microscopia òptica Cristina Vázquez Sánchez
Microscopi de contrast interferencial (DIC o Nomarski)
- També utilitza les diferències entre els índex de refracció, però és més sofisticat.
Se basa en el efecto de la interferencia al combinarse las ondas desfasadas. La luz se polariza y se divide en rayos principales y rayos de interferencia, que son separados por placas birrefringentes o prismas. Unos rayos pasan a través del objeto y otros a través del medio, y cuando se unen los dos rayos en condiciones adecuadas se originan interferencias que dan lugar a imágenes de diferentes colores. Utilidad Células vivas sin teñir. Ventajas respecto al microscopio de contraste de fase
- Se reducen artefactos ópticos: halo de fase (brillante, de contorno) por cambio brusco del índice de refracción.
- Permite el uso de toda la apertura numérica Más poder de resolución y permite la disección óptica (diferenciar diferentes planos).
Inconvenientes
- Se genera un falso volumen de la muestra.
- Es más caro porque incluye prisma y polarizador.
- No se pueden analizar muestras con birrefringencia ni en soporte plástico (placa de Petri o placa de cultivo celular) debido al uso de la luz polarizada.
Aquestes larves són
molt utilitzades als
estudis de
desenvolupament
embrionari.
1: Microscopia òptica Cristina Vázquez Sánchez
Microscopi de fluorescència
En este caso, para marcar la muestra se utilizan anticuerpos marcados con fluorocromos Moléculas que se excitan con una determinada longitud de onda y emiten luz de una longitud de onda mayor (menos energética) para volver así a su estado basal. (Cuanto más pequeña sea la longitud de onda Más energía)
El marcaje de los Ac puede ser de forma directa o de forma indirecta (como en el esquema anterior), utilizando un anticuerpo primario que reconozca el antígeno y un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia que reconozca el anticuerpo primario.
1: Microscopia òptica Cristina Vázquez Sánchez
Este microscopio actúa con varios filtros (que se pueden cambiar en función de la imagen que se quiera obtener,
pueden modificarse los filtros y su apertura, pueden ser dobles e incluso triples Estos permiten que pase más de
una longitud de onda).
Por ejemplo, tenemos una fuente de luz de 450-490nm, y el fluorocromo FITC se excita con esta longitud de onda.
- El segundo filtro actúa como espejo, refleja la luz de determinada longitud de onda y llega a la muesrea,
excitando a los fluorocromos con esta , emitiendo así otra diferente Emite a unos 512nm aprox, y es la que
llega a nuestros ojos.
En un microscopio de fluorescencia solo se ve lo que ha estado marcado con fluorescencia.
Además de anticuerpos marcados con fluorocromos, se pueden utilizar “colorantes” de fluorescencia, que en
presencia de determinadas moléculas emiten luz de otro color.
Ejemplo de uso:
El colorante es azul, y en contacto con la molécula Ca (calcio) varia el color (según la cantidad y la tabla de la leyenda). o En la imagen se ve un oócito. Cuando entra el espermatozoide, el óvulo emite calcio para que no puedan entrar otros espermatozoides Así, según el color, se puede ver la cantidad de calcio que hay y el estado de la fecundación.
Hibridación in situ fluorescencia
En este caso se marcan los nucleótidos con sondas, y se utilizan sondas (existen de varios tipos). Permite la localización de secuencias específicas de ADN sobre cromosomas, células o tejidos, se basa en la capacidad del ADN de unirse a una cadena complementaria.
Sirve para ver anomalías cromosómicas.
1: Microscopia òptica Cristina Vázquez Sánchez
(AMPLIACIÓN SONDAS PARA VER TRANSLOCACIONES)
Tipos de sondas para translocaciones
- La hibridación in situ en onco hematología se usa sobre todo para ver translocaciones, se usan éstas dos sobretodo.
- Cada una está formada por dos de locus específico.
Sondas de Split o Break-Apart:
Se utilizan 2 sondas que cubren el punto de rotura del oncogén implicado en la translocación (cada sonda en un punto de la rotura)
Se marcan con distintos fluorocromos el extremo 5’ y 3’ del oncogén de interés Hay genes con tendencia a translocarse, en un punto concreto. No interesa saber dónde ha sido la translocación o “a dónde se ha ido”; si no simplemente si “se ha ido”. Si no hay translocación, las dos sondas estarán muy juntas y se verá una fusión (dos, una por cada cromosoma). Si hay translocación, una de las dos están separadas. Si solo se ve una fusión es porque ha habido deleción de un gen.
Sondas de Doble Fusión:
Se utilizan 2 sondas marcadas con distintos florocromos: una marca el oncogén (siempre orange) y la otra el gen de las IgH (siempre en verde) Compuesta por dos sondas específicas de locus, una sonda para cada gen
Si se quiere ver una translocación entre dos genes, se marca cada uno de un color En una célula normal sin translocación se verán dos señales verdes y dos naranjas
Translocación Dos fusiones (la sonda está diseñada para abarcar la banda de rotura, y aunque esté hibridada se marcará igual). Se intercambian y se cruzan las dos.
1: Microscopia òptica Cristina Vázquez Sánchez
Es similar al de florescencia pero elimina la señal que está fuera del foco (lo que no está enfocado). Así solo ves el plano que te interesa.
Tenemos luz láser monocromática, que pasa a través de un diafragma confocal iluminando la muestra en un solo punto o plano, La florescencia emitida por este punto plano se enfoca en otro diafragma confocal de tal forma que la luz emitida por el resto de la muestra no formará parte de la imagen final. La luz es recibida o captada por fotomultiplicadores y es digitalizada. Finalmente es analizada con un programa informático. Se obtienen imágenes de cada plano de la muestra y se pueden reagrupar para hacer reconstrucciones tridimensionales.
Ejemplo de uso
En la imagen B se ve más claro y definido, en un único plano.
- Se puede “reconstruir” la imagen 3D haciendo varios barridos de todos los planos de la muestra
Microscopi de deconvolució
- No se usa un láser ni luz UV, se usa un software informático.
- Eliminan todas las imágenes, solo los puntos donde la fluorescencia es máxima.
- Enfoca la muestra a varios planos, al final hace una reconstrucción y captura de cada plano el punto donde la fluorescencia es máxima, y elimina el resto. Así, la imagen es más nítida.
1: Microscopia òptica Cristina Vázquez Sánchez
Microscopi de fluorescència amb súper resolució
STORM (Microscòpia de reconstrucció òptica estocàstica): La mostra s'il·lumina amb llum de diferents
longituds d’ona durant diversos cicles de temps molt curts. A cada cicle tan sols algunes molècules
s’exciten de forma aleatòria. Això permet localitzar-les amb molta precisió, tenir una distribució
aproximada de les molècules i incrementar la resolució que pot arribar als 20nm.
