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MANUAL DE PRÁCTICAS

DE LABORATORIO

BIOLOGÍA CELULAR

Francisco Martínez Pérez

Editor

Escuela de Biología

Facultad de Ciencias

Universidad Industrial de Santander

Bucaramanga, 2017

Francisco José Martínez Pérez

Francisco José Martínez Pérez

Manual de Prácticas de Laboratorio: Biología Celular Escuela de Biología Facultad de Ciencias Universidad Industrial de Santander

Francisco José Martínez Pérez Profesor de la Escuela de Biología Facultad de Ciencias Universidad Industrial de Santander

Decano de la Facultad de Ciencias: David Miranda Mercado Directora de Escuela de Biología: María Isabel Criales Hernández Asesoría pedagógica: Esperanza Revelo Jiménez -Cededuis Diseño gráfico, organización y estructura: Virginia Gavilán Díaz – Cededuis Blanca Inés Arboleda González -Cededuis

Primera edición, 2017

Manual de prácticas de Laboratorio de Biología Celular

INTRODUCCIÓN

La Biología Celular es la rama de la Biología que estudia todos

los elementos que componen a las células. Entendiendo la

célula como la unidad fundamental de la vida que tiene la

capacidad de crecer, reproducirse y generar su propia muerte.

Las células pueden estar: en forma única, en agregados o

formando colonias u órganos, los cuales en el caso de muchos

hongos, plantas y animales pluricelulares forman sistemas.

El estudio de las células se soporta en diferentes

procedimientos metodológicos de laboratorio que se

fundamentan en reacciones químicas con sus moléculas y sus

características físicas; con ello se ha logrado conocer sus

componentes y los procesos que realizan. Desde esta

perspectiva el presente Manual de Técnicas de Biología Celular

para la Asignatura de Biología Celular de la Escuela de Biología

de la Facultad de Ciencias de la Universidad Industrial de

Santander tiene como directriz lo estipulado en el plan de

estudios de la Escuela de Biología. Su principal objetivo es

introducir a los estudiantes o usuarios interesados en brindarles

una serie de fundamentos básicos que les permitirá

comprender una pequeña parte del fascinante e increíble

mundo de la Biología Celular.

El manual consta de ocho prácticas y cuatro Anexos. La primera

está divida en dos partes con el fin de aprender las

características de los reactivos químicos que tiñen a las células.

La segunda práctica con título fraccionamiento celular también

está dividida dos partes en la primera se resalta la importancia

del rompimiento de la célula o tejidos para la obtención de

organelos, mientras que la segunda da las bases del

Manual de prácticas de Laboratorio de Biología Celular

ÍNDICE GENERAL

CAPITULO 1

PRÁCTICA 1. CONDUCTA DE ENTRADA:

CONCEPTOS QUÍMICOS Y BIOQUÍMICOS.

1.1 Introducción

1.2. Competencias.

1.3. Materiales y reactivos para la práctica.

1.4. Desarrollo de la primera parte de la práctica (Parte A).

1.4.1. Preguntas para foro de discusión

1.4.2. Procedimiento de laboratorio.

1.4.3 Desarrollo de la segunda parte de la práctica (Parte B).

1.4.4 Resultados Esperados.

1.5. Informe de la práctica.

1.6. Referencias de apoyo.

CAPITULO 2

PRÁCTICA 2. FRACCIONAMIENTO CELULAR (PARTE

A), LISIS CELULAR

2.1. Introducción.

2.2. Competencias.

2.3. Materiales y reactivos para la práctica.

Francisco José Martínez Pérez

2.4. Desarrollo de la primera parte de la práctica (Parte A).

2.4.1. Preguntas para foro de discusión.

2.4.2. Procedimiento de laboratorio.

2.4.2.1. Fraccionamiento con Mortero.

2.4.2.2. Fraccionamiento con cuchillas mediante procesador de

alimentos.

2.4.3. Resultados esperados.

2.5. Informe de la práctica.

2.6. Referencias de apoyo.

CAPITULO 3

PRÁCTICA 2. FRACCIONAMIENTO CELULAR (PARTE

B), CENTRIFUGACIÓN CONTINUA

3.1. Introducción.

3.2. Competencias.

3.3. Materiales y reactivos para la práctica.

3.4. Desarrollo de la primera parte de la práctica (Parte B).

3.4.1. Preguntas para foro de discusión.

3.4.2. Procedimiento de laboratorio. Centrifugación diferencial.

3.4.3. Resultados esperados.

3.5. Informe de la práctica.

3.6. Referencias de apoyo.

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5.4.2. Procedimiento de laboratorio.

5.4.3. Resultados esperados.

5.5. Informe de la práctica.

5.6. Referencias de apoyo.

CAPITULO 6

PRÁCTICA 5. AISLAMIENTO DE NÚCLEOS.

6.1. Introducción.

6.2. Competencias.

6.3. Materiales y reactivos para la práctica.

6.4. Desarrollo de la práctica.

6.4.1. Preguntas para foro de discusión.

6.4.2. Procedimiento de laboratorio.

6.4.3. Resultados esperados.

6.5. Informe de la práctica.

6.6. Referencias de apoyo.

CAPITULO 7

PRACTICA 6. AISLAMIENTO DE MITOCONDRIAS.

7.1. Introducción.

7.2. Competencias.

Manual de prácticas de Laboratorio de Biología Celular

7.3. Materiales y reactivos para la práctica.

7.4. Desarrollo de la práctica.

7.4.1. Preguntas para foro de discusión.

7.4.2. Procedimiento de laboratorio.

7.4.3. Resultados esperados.

7.5. Informe de la práctica.

7.6. Referencias de apoyo.

CAPITULO 8

PRÁCTICA 7. AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS

8.1. Introducción.

8.2. Competencias.

8.3. Materiales y reactivos para la práctica.

8.4. Desarrollo de la práctica.

8.4.1. Preguntas para foro de discusión.

8.4.2. Procedimiento de laboratorio.

8.4.3. Resultados esperados.

8.5. Informe de la práctica.

8.6. Referencias de apoyo.

Manual de prácticas de Laboratorio de Biología Celular

PRÁCTICA 1

CONDUCTA DE ENTRADA: CONCEPTOS QUÍMICOS Y BIOQUÍMICOS

1. 1. Introducción

Los seres vivos están conformados por células, las cuales tienen en común su composición en diferentes combinaciones de proteínas, azúcares, lípidos y ácidos nucleicos. Por esta característica, para su estudio, desde el principio de la ciencia, se han empleado sustancias que al reaccionar con algún metabolito celular se logra observar: su morfología, los componentes que la conforman o determinar los procesos que desarrolla consigo misma y/o con otras células dentro de organismos pluricelulares o unicelulares.

Por lo anterior, se han purificado, generado y/o desarrollado infinidad de sustancias también denominados reactivos químicos cuyo uso es mediante protocolos sustentados en sus propiedades. Desde esta perspectiva se pueden definir dos tipos generales de reactivos para el estudio celular, los primeros permiten generar señales químicas que pueden ser observadas y/o cuantificadas por métodos físicos, a través de equipos que cuantifican o digitalizan la señal física como son los microscopios. Ejemplo de ellos son moléculas que pueden generar un color, luz o la desintegración radioactiva de alguno de sus átomos, después de reaccionar o incorporarse con un metabolito

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celular. Mientras que los otros reactivos permiten identificar y cuantificar algún producto metabólico celular y con ello es posible establecer las rutas de su biosíntesis o su participación en la fisiología y ecofisiología donde él o las especies que lo sintetizan.

Para el caso de los compuestos químicos que generan una señal luminosa o cuyos electrones reflejan fotones cuando son excitados a determinada longitud de onda, como las que se generan con microscopía, los reactivos se clasifican en: Básicos, Ácidos, Neutros e Indiferentes, algunos ejemplos de ellos se indican en la Tabla 1.

Reactivos básicos Son sales que tienen dos regiones, la parte básica aporta el color, mientras que la ácida es incolora. Dada esta característica, la región básica reaccionara preferentemente con las moléculas ácidas de la célula, siendo las principales los ácidos nucleicos (ADN, ARN), proteínas, aminoácidos, ácidos o glicosaminoglicanos.

Por lo tanto, en células eucariontes en donde se encuentren de forma mayoritaria se logra la visualización del orgánulo que los contiene, por ejemplo: el núcleo, las mitocondrias, los cloroplastos y el ARN mensajero presente en los ribosomas. Algunos reactivos básicos son: Tionina, Safranina, Azul de toluidina, Azul de metileno y la Hematoxilina.

Reactivos Ácidos En este tipo de reactivos, el anión es el que genera el color, en tanto que la base es incolora por ello se observan por microscopía, las estructuras celulares que incluyen proteínas compuestas de

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azucares que componen las membranas y la pared celular. Ejemplo de estos reactivos es el reactivo Sudán IV.

Todos los reactivos tienen diversas medidas de seguridad las cuales determinan su manejo, uso, aplicación, almacenamiento y desecho. Los detalles de las medidas de ellas, tipos de laboratorios para su empleo y uso, se indican en el Anexo seguridad en laboratorios. Otra ventaja que presentan los reactivos para tinciones celulares es que de acuerdo a la concentración en la que se encuentren y los tiempos de exposición con el tejido o células y las longitudes de onda con la que se excite la muestra se determina de distinta manera los componentes celulares.

Esta primera práctica se divide en dos secciones: en la primera se mostrarán las características y aplicaciones y seguridad de los reactivos para tinción en Biología Celular. Posteriormente se realizará la tinción de células musculares de pollo con los reactivos: Sudán IV, Azul de Metileno, Eosina y Rojo Congo para observar las diferencias de tinción en función de su dilución en el microscopio óptico.

En la segunda parte de esta práctica se observará en el microscopio la tinción que realizan los mismos reactivos en tejidos oculares, músculo e hígado de pollo y hojas de espinaca con la mejor dilución observada en la primera parte de la práctica.

1.2. Competencias

 Reconoce los elementos de seguridad activa y pasiva de un reactivo.

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 Identifica la tinción de células musculares.  Aprende el uso y manejo de los reactivos ácidos, básicos, neutros e indiferentes en la tinción de células musculares de pollo.  Distingue y comprende los diferentes tipos de coloración que generan reactivos a distintas diluciones.  Encuentra las diferencias en tinción que se observan en células animales y vegetales.

1.3. Materiales y reactivos para la práctica

 Tabla de madera cubierta con papel aluminio.  Micropipeta y puntas de 1000 l.  Tubos Eppendorf de 1.5 ml.  Láminas porta y cubre objetos.  Microscopio marca NIKON modelo ECLIPSE E200.

 Tejidos y soluciones.  Hojas de espinacas, pechuga, ojo e hígado de pollo.  Sudan IV, Azul de Metileno, Eosina y Rojo Congo todos ellos en una dilución 1:10, 1:100 y 1:1000 en amortiguador fosfatos (HPO4/H3PO4 pH 7.4) (volumen a volumen).  Agua desionizada.

 Material requerido por los estudiantes  Bata de laboratorio.  Guantes.  Las personas con cabello largo emplear cofia.  Mango de bisturí con hoja o cuchilla.  Pinza hemostática.

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3. Indicaciones relacionadas a las características de los reactivos Sudán IV, Azul de Metileno, Eosina y Rojo Congo que se emplearán en la práctica.
4. Suministro de tubos Eppendorf con diluciones 1:10, 1:100, 1:1000 volumen a volumen en 1000 μL (micro litros) de los reactivos de tinción Sudán IV, Azul de Metileno, Eosina y Rojo Congo.
5. A partir de músculo de pollo realice cortes delgados de aproximadamente 2 cm de largo y 0.5 cm de ancho con un bisturí.
6. Coloque los cortes en cada una de las diluciones a cada uno de los reactivos e incube por 5 min a temperatura ambiente.
7. Retire la solución de cada tubo y mantener el tejido dentro de él. A este realice 3 lavados con 1 ml de agua desionizada por 3 min cada uno a temperatura ambiente.
8. Coloque en un portaobjetos cada una de las tinciones y observe al microscopio para determinar el efecto de cada tinción en las células musculares.

1.4.3. Desarrollo de la segunda parte de la práctica

(Parte B)

1. Realice cortes delgados de aproximadamente 2 cm de largo y 0.5 cm de ancho con un bisturí de: ojo, hígado, y hojas de espinacas.
2. Revise los tubos Eppendorf con soluciones de los reactivos de tinción: Sudán IV, Azul de Metileno, Eosina y Rojo Congo

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en una dilución 1:100, volumen a volumen en 1000 μL agua desionizada.

3. Colocar los cortes en la dilución de cada uno de los reactivos he incubar por 5 min a temperatura ambiente.
4. Retire la solución de cada tubo y mantenga el tejido dentro de él. A este, realice 3 lavados con 1 ml de agua desionizada por 3 min cada uno a temperatura ambiente.
5. Coloque cada corte en un portaobjetos y extender gentilmente para no dañarlo.
6. Observe cada una de las tinciones al microscopio.
7. Obtenga las fotografías correspondientes para observar las características de cada tinción.

1.4.4. Resultados Esperados

Se observarán diferentes niveles de tinción dependiendo de la dilución independientemente del tejido. Las estructuras que se observen en cada tinción están en función de cada tejido. Para comparar sus resultados con los de otros autores se anexan las publicaciones correspondientes a cada reactivo las cuales están disponibles en la página del curso.

1.5. Informe de la práctica.

El informe del laboratorio debe de ser acorde a los lineamientos establecidos en el programa académico de la asignatura Biología Celular (ver Anexo 4).