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GENÉTICA HUMANA
TEMA 1: Los cromosomas humanos
Estudio de la genética: genética de transmisión, genética de poblaciones, genética molecular y citogenética.
La genética fue avanzando poco a poco a partir de la publicación del origen de las especies, pero a partir de los 70s, sufrió un gran boom y avanzó rápidamente gracias a la nueva tecnología que iba surgiendo.
La citogenética es el estudio de los cromosomas a nivel microscópico (número, estructura, función) usando metodologías de análisis cromosómico. Esto tiene interés debido a que las anomalías cromosómicas son importante causa de mortalidad y morbilidad se ven afectados:
- (^) 1/150 nacidos vivos.
- 50% abortos en el primer trimestre, y el 6% en el segundo.
- Son la mayor causa de defectos de nacimiento.
- Se encuentran en muchas de las formas del cáncer.
Por tanto, este estudio tiene aplicaciones médicas como el diagnóstico clínico y prenatal, así como realizar ligamientos y mapeos.
Hitos principales en el desarrollo de la Citogenética humana:
- 1956: Tjio & Levan y Ford y Hamerton idearon una técnica para separar los cromosomas de una cell y así poder contarlos y establecer el número correcto de estos.
- (^) 1970: se introdujeron técnicas de bandeo cromosómico.
- 1980: se introdujeron métodos de citogenética molecular.
La palabra cromosoma proviene de: “Croma”=color; “Soma”=cuerpo. Y son unas estructuras filamentosas que conforman el soporte físico en el que se encuentra el genoma de una cell. Son vehículos que aseguran la reproducción y el mantenimiento de la especie, ya que gracias a ellos, en la mitosis, cada cell hija recibe el número correcto de material genético (aseguran una transmisión fiel).
El complemento haploide de una especie es el número de cromosomas diferentes que tiene esa especie. Se representa con una “c”. En cambio, la
ploidía , es el número de veces que se repite el complemento haploide (en la especie humana, hay cells hapliodes, diploides y poliploides en el hígado).
Estructura cromosómica :
- Centrómero: permite la migración durante la división cell. Divide a los cromosomas en brazos cortos (p) y largos (q).
- Telómeros: son los extremos y son secuencias repetidas (tándem repeats= TTAGGG) que se encargan de mantener la integridad de los cromosomas. Se mantienen gracias a la telomerasa, la cual no se encuentra en las cells adultas, por lo que la mida de los telómeros se va a cortando con la edad.
- Orígenes de replicación: donde empieza la replicación en la interfase, para asegurar que cada cell hija tenga la misma cantidad de material.
Elementos necesarios para la replicación y segregación cromosómica
Para que los 2m de ADN puedan contenerse en el núcleo de las cells, ha de estar perfectamente empaquetado. Se han definido varios niveles de empaquetamiento:
- Cromatina de 11nm: fibra de ADN + ARN + proteínas histónicas (H1, H2A, H2B, H3 y H4) + proteínas no-histónicas (factores estructurales y de transcripción). Es una sucesión de nuecleosomas (nucleofilamento).
- Solenoide: fibra de 30nm y es el enrollamiento sobre sí misma de la fibra de 11nm. En cada vuelta hay seis nucleosomas.
- Se forman una serie de bucles formando los dominios estructurales en forma de bucles. Estos bucles se sitúan sobre un soporte proteico formado principalmente de proteínas ácidas como las topoisomerasas. La fibra de ADN se une al soporte proteico mediante dominios ricos en TA.
- Se acaba de condensar para formar los cromosomas metafásicos.
Comportamiento de los cromosomas durante el ciclo celular :
Further mitotic divisions
Diploid primordial germ cells migrate to embryonic gonad
Meiosis IIMeiosis IMaturation of spermatids produces spermatozoa
En el ser humano, hay una gran diferencia en la meiosis de las células sexuales entre hembras y machos. En la mujer, durante la gestación, el ciclo celular queda detenido en el diploteno y la célula sigue madurando cuando empiezan los ciclos menstruales, Por el contrario, en el hombre, los espermatozoides están continuamente dividiéndose (64 divisiones seguidas). A consecuencia de esto, las enfermedades de origen cromosómico son normalmente de origen materno, mientras que las causadas por mutaciones, son más frecuentes en hombres.
La profase de la meiosis I puede dividirse en 5 estadios:
- leptoteno: los cromosomas son finas hebras desapareadas compuestas por 2 cromátidas hermanas estrechamente ligadas;
- zigoteno: los homólogos materno y paterno se aparean y forman bivalentes;
- paquiteno: los cromosomas de hacen más gruesos y tiene lugar el entrecruzamiento;
- diploteno: los homólogos se separan pero se mantienen unidos por los quiasmas (forman la cruz de resolución);
- diacinesis: los bivalentes están aún más condensados.
Cromosomas metafásicos : estos son muy accesibles/visibles, porque es cuando más condensada se encuentra la cromatina. Estructura general:
Como se puede ver, se pueden dividir en grupos en función de diversos parámetros: la longitud (de 25010^6 bp a 5010^6 bp), la posición del centrómero y la presencia/ausencia de satélites (acumulación de rRNA, son los brazos cortos de los acrocéntricos). Además, en las ratas hay un tipo más, los telocéntricos, que no tienen brazos cortos. Morfológicamente se pueden dividir en 7 grupos:
- A (1-3) cromosomas más grandes/largos. 1 y 3 son metacéntricos, y 2 submetacéntrico. El 1 tiene una banda de heterocromatina constitutiva en la región proximal del brazo largo (1q).
- B (4-5) submetacéntricos grandes con dos brazos muy distintos.
- C (6-12 + X) medianos, submetacéntricos. 9q proximal tiene banda de heterocromatina.
- D (13-15) medianos, acrocéntricos con satélites.
- E (16-18) cortos, 16 es metacéntrico, 17 y 18 son submetacéntricos. 16q proximal tiene banda de heterocromatina.
- F (19-20) los metacéntricos más pequeños.
- G (21-22 + Y) pequeños y acrocéntricos. Hay satélites en 21 y 22, pero no en el Y (por esto no es acrocéntrico). Casi todo su brazo largo es heterocromatina constitutiva, por eso una persona con una deleción en esta región no tendrá un pronóstico muy grave. El cariotipo humano se ordena según el tamaño de los cromosomas, de más grande a más pequeño. Pero con una excepción: el 21 es más pequeño que el 22. Pero se conservó este orden ya que antes que se conociese el tamaño, ya se había identificado el 21 como causante del Síndrome de Down.
Técnicas de estudio de los cromosomas: en el estudio de estos puede interesar la variación, con lo que se hace una identificación, una separación u otras técnicas, o la identificación de cromosomas individuales, para lo que se usan técnicas de bandeo o técnicas moleculares.
Las diferencias de las bandas cromosómicas se deben a que dentro de la estructura de los cromosomas hay diferencias funcionales, estructurales y composicionales.
*SAR= Scafold Attachment Region. Regiones donde se unen la cromatina y el esqueleto proteico (ricas en AT).
- Las bandas G son más insensibles a las DNAasa porque estas tienen mayor dificultad para pasar por los pequeños loops, que están en mayor número (por el número de regiones AT).
- Citogenética molecular: técnicas moleculares para el estudio de la cromatina y poder hacer un estudio más fino de las cromosomopatías, de la estructura cromosómica, par la identificación subcromosómica o para estudios de evolución.
Se basan en la hibridación de 2 ADNs, uno de ellos es la diana y el otro está marcado.
- FISH ( fluorescence in situ hibridization ): se ha de hacer una extensión, purificación y desnaturalización de la preparación. ¡Clones de ADN purificado! Luego se han de obtener sondas marcadas. Para que sean operativas han de tener unos 40 kb, y los fluorocromos que se suelen usar son: AMCA (azul), fluoresceína (verde), CY3 (rojo), rodamina (rojo), texas red (rojo). Luego se produce la hibridación y se observa en el microscopio de fluorescencia.
Puede ser una técnica directa o indirecta. Directa : se va rompiendo el ADN (sonda) y se repara metiendo nucleótidos marcados fluorecentemente. Indirecta : para reparar el ADN se añaden nucleótidos con un hapteno, cuya presencia puede ser detectada mediante una reacción enzimática sencilla. En algunos casos, como cuando se tiene poco material para estudiar, la señal que produce esta técnica es mejor porque se ve amplificada.
Se ha conseguido aumentar mucho la resolución del FISH, debido a diversos factores: resolución de la sonda existen librerías de todo tipo de sondas:
subteloméricas, puntos de rotura, centroméricas, regionales, genómicas, fibras de ADN, para microarrays; diana también existe una amplia biblioteca, ya que se usan cromosomas metafásicos (5Mb), cromatina en interfase (50kb-200Mb), fibras de cromatina (5-500 kb), microarrays de ADN (single-nucleotide level).
- Pintado cromosómico estándar: sirve ante una muestra heterogénea de muchos clones de ADN con inserciones de muchas regiones diferentes provenientes de un único cromosoma.
Se ha de hacer una extensión cromosómica, se desnaturaliza el ADN y se separan las hebras. Luego se escoge la sonda específica complementaria al fragmento que se quiere estudiar.
- M-FISH: se basa en el marcaje combinatorial. Se combinan los fluorocromos, ya que hay 4-5 de estos para 22 cromosomas existentes. Gracias a un análisis de imagen digital, se puede transformar casa combinación de fluorocromos en un pseudocolor.
- SKY ( Spectral karyotyping ): es una técnica novedosa basada en el FISH.
- COBRA ( Combines binary ratio labelling ): es como el M-FISH pero esta técnica juega con la proporción entre los fluorocromos.
- Hibridazión genómica comparativa (CGH): es una técnica citogenética mediante la cual es posible identificar y analizar alteraciones genéticas en un segmento cromosómico del tipo duplicaciones o deleciones y reordenamientos no equilibrados. Existen 2 modalidades: - Preparación en metafase. Consiste en obtener una muestra de “sangre sana” de un individuo, sonicarla para que se divida en pedazos y teñirla de rojo. Después se obtiene una muestra de la “zona enferma” o zona de interés para el análisis del mismo individuo y se realiza lo mismo, pero tiñendo con verde.
Los cromosomas en metafase se fijan a un porta y se marcan con DAPI de modo que se verán de color azul bajo el microscopio de fluorescencia. Tras esto, se realiza una hibridación in situ de estas dos preparaciones. Estos ADNs competirán por hibridar en los mismos sitios, reportando una fluorescencia amarilla (rojo+verde) en los lugares del cromosoma en los que ambas muestras se encuentren en una proporción normal. Si la muestra a estudiar contiene una deleción, se observará un color rojo (ausencia del color verde que es el que tiene la muestra). O, si por el contrario, hay una duplicación, se observará una emisión verde.
Limitaciones: no sirve para mutaciones puntuales, ni para detectar mutaciones sin ganancia/pérdida de material, ni poliplodias.
- Preparación con micro-arrays. Este tipo de CGH difiere del anterior principalmente en que es capaz de detectar variaciones de un menor número de kilobases (kb) y en que no es necesario obtener las muestras en metafase.
