Protocolo de práctica
Área de Fisiología Vegetal
Departamento de Botánica, Ecología y Fisiología Vegetal
Facultad de Ciencias
Universidad de Córdoba Prácticas de Fisiología Vegetal
Título: Determinación de antioxidantes totales hidrosolubles en
semillas de pimienta.
Advertencias y recomendaciones previas:
- Lea detenidamente el protocolo.
- Procure resolver todas las dudas antes de comenzar.
- Mantenga presente en todo momento las advertencias de seguridad para el trabajo en el laboratorio.
1. Introducción
Las plantas, igual que todos los organismos vivos, generan espontáneamente especies químicas muy
reactivas procedentes fundamentalmente del metabolismo del oxígeno y, en menor medida, del
metabolismo del nitrógeno. Algunas de estas especies son imprescindibles para el mantenimiento normal
del metabolismo; sin embargo, cuando sus niveles son excesivamente elevados pueden tener efectos
nocivos. Además, las plantas están expuestas a la acción de agentes oxidantes externos. Como respuesta
a la presencia de estas especies reactivas, tanto de origen interno como externo, las plantas presentan una
serie de sistemas de defensa tanto enzimáticos como no enzimáticos. Entre los no enzimáticos se
encuentran sustancias conocidas como antioxidantes. Entre ellos se encuentran el ácido ascórbico (vitamina
C), los tocoferoles (vitamina E), el glutatión, los carotenoides y los compuestos fenólicos.
Aparte de sus funciones biológicas naturales, los compuestos antioxidantes de origen vegetal
presentan grandes aplicaciones en el mundo de la alimentación, la medicina y la cosmética. El auge en los
proyectos de búsqueda de nuevos antioxidantes naturales ha servido de acicate para el desarrollado de
numerosos métodos de determinación de la capacidad antioxidante tanto de sustancias puras como de
mezclas complejas como los extractos de plantas.
Existe una multitud de métodos de terminación de antioxidantes. En esta práctica se ensayará un
método espectrofotométrico, muy sencillo, basado en la formación de un complejo coloreado (verde
azulado) de fosfato y molibdeno (V). El fundamento del método radica en la capacidad de los antioxidantes
de reducir el molibdeno (VI) a molibdeno (V), el cual, en presencia de fosfato a pH ácido, forma un complejo
fosfomolíbdico de color azul cuyo espectro de absorción presenta un máximo a 695 nm.
Antioxidante (red) + fosfato + Mo(VI) + H+ → Antioxidante (ox) + complejo fosfato/Mo(V)
(color azul)
En el ensayo, que contiene una mezcla de reactivo fosfomolíbidico y la muestra con antioxidantes,
las moléculas de antioxidante, que son compuestos reductores, reaccionan con el Mo (VI) y lo reducen a
Mo(V), al tiempo que ellos se oxidan.
Una vez transcurrida la reacción, se mide la absorbancia en el azul (a 695 nm), que será
proporcional a la cantidad de antioxidantes presentes en la muestra y que se denomina capacidad
antioxidante. Para la calibración del método se emplean antioxidantes conocidos como el ácido ascórbico,
de modo que la cantidad de antioxidantes hidrosolubles totales, o sea la capacidad antioxidante hidrosoluble
total (CAH) se expresa en equivalentes de ácido ascórbico.
2. Material
Semillas; mortero; pipetas; balanza; microfuga; bloque térmico; espectrofotómetro; cubetas de
espectrofotómetro de 1 ml; tubos Eppendorf; hielo picado; ácido sulfúrico, fosfato sódico; molibdato
amónico; solución de ácido ascórbico; agua destilada.
3. Procedimiento
