BIOQUíMICA II
MEMORIA PRÁCTICA 4
ACTIVIDAD DE LA ENZIMA LIPASA. SEGUIMIENTO
LIPOLISIS POR TURBIDIMETRÍA
Profesor: Joaquín Carrasco Luna
Componentes del grupo:
Paula Giménez Meliá
Mireia Planas Andreu
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Memorias Laboratorio, Guías, Proyectos, Investigaciones de Bioquímica
Memorias laboratorio segundo biotecnología
Tipo: Guías, Proyectos, Investigaciones
2018/2019
1 / 13
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BIOQUíMICA II
MEMORIA PRÁCTICA 4
ACTIVIDAD DE LA ENZIMA LIPASA. SEGUIMIENTO
LIPOLISIS POR TURBIDIMETRÍA
Profesor: Joaquín Carrasco Luna
Componentes del grupo:
Paula Giménez Meliá
Mireia Planas Andreu
ÍNDICE
1. Objetivo
2. Introducción
3. Materiales
4. Procedimiento
5. Métodos
6. Resultados
7. Discusión
8. Cuestiones
9. Conclusión
10. Bibliografía
Imagen 3
- Agitador magnético Imagen 4
- Pececillos magnéticos
- Gradilla de tubos eppendorf Imagen 5
- 2 tubos de 10 ml de tapón de rosca fondo plano Imagen 6
- 7 tubos eppendorf de 2 ml
Imagen 7
- Pipetas automáticas: 1000, 200 y 20 μl Imagen 8 Reactivos utilizados:
- Lipasa de páncreas porcino
- Tampón Tris 100 mM a pH 7,
- Aceite de oliva
- Albúmina de suero bovino
- HCl concentrado 4. Procedimientos En esta práctica podemos distinguir 2 procedimientos distintos:
- Lipoproteína artificial
- Se mezclan en un eppendorf 97 μl de aceite de oliva y 903 μl de disolución de goma arábiga al 2% en tampón de ensayo. Se emulsiona bien en sonicador hasta obtenerse un aspecto blanco lechoso (sonicar 20 min).
- Se mezclan en tubo eppendorf 40 μl de esta emulsión con 960 μl de disolución de BSA al 5% en tampón de ensayo, se agita suavemente y se incuba a 30 grados durante 20 min. Guardar a temperatura ambiente.
- Seguimiento de la hidrólisis de lípidos por turbidimetría Los productos de la hidrólisis de los triglicéridos producen un cambio de las propiedades de la emulsión que hace disminuir la turbiedad.
6. Resultados TURBIDEZ Tiempo (mins) 0 μ ppL 40 μ ppL 100 μ ppL 200 μ ppL 0 0,2291 0,1895 0,2660 0, 5 0,2233 0,194 0,2745 0, 10 0,2201 0,1993 0,2569 0, 15 0,2211 0,1944 0,2526 0, 20 0,2212 0,1873 0,2479 0, 25 0,2192 0,177 0,2338 0, 30 0,216 0,158 0,2254 0, 35 0,2169 0,147 0,2026 0, 40 0,2179 0,1302 0,1996 0, 45 0,2159 0,1267 0,1923 0, Tabla 2: Datos turbidez en crudo Tiempo (mins) 0 μ ppL 40 μ ppL 100 μ ppL 200 μ ppL 0 1 1 1 1 5 0,9747 1,0237 1,0319 0, 10 0,9607 1,0517 0,9657 0, 15 0,965 1,0258 0,9496 0, 20 0,9655 0,9883 0,9319 0, 25 0,9567 0,934 0,8789 0, 30 0,9428 0,8337 0,8473 0, 35 0,9467 0,7757 0,7616 0, 40 0,9511 0,6871 0,7504 0, 45 0,9423 0,6686 0,7229 0, Tabla 3: Datos normalizados
Gráfica 1: Cinética normalizada completa. Gráficas de la fase inicial. Gráfica 2: Fase de activación Gráfica 3: Fase de activación
Gráfica 7: Fase de activación Gráfica 8: Fase de activación Gráfica 9: Fase de activación
Gráfica 10: velocidad de hidrólisis
7. Discusión En la tabla 2 podemos observar los datos en crudo. En estos datos se muestra la variación de la turbidez en la muestra en la que no hay lipasa, esto no es correcto porque como no hay lipasa no se puede producir hidrólisis por lo que tampoco debería haber variación en la turbidez. Aunque la variación de turbidez en nuestras muestras no es muy significativa debido a que no varía mucho. Esto es causado por un error durante la toma de medidas. En la tabla 3 se aprecian los datos normalizados en estos ya se puede observar una mayor apreciación de las diferentes cinéticas. En las gráficas de la fase inicial (gráfica 2,3,5) deberíamos observar una línea constante pero este resultado solo lo obtenemos en la gráfica 5. Por tanto a excepción de la gráfica 5 en las otras se obtiene una velocidad de reacción que es incoherente. En estas gráficas analizamos la variación en la cinética cuando no se ha añadido el enzima es decir a (0 μL de enzima). En la gráfica 10 se aprecia la velocidad de hidrólisis, para realizar esta gráfica hemos utilizado las pendientes de las rectas de la fase inicial. Como podemos observar en este caso no hemos realizado un gráfico de dispersión si no que se trata de un gráfico de barras en el cual se representan las diferentes velocidades la menor velocidad de reacción la encontramos en la muestra donde pusimos 40 μL de enzima y la mayor velocidad de reacción la encontramos en la muestra donde pusimos 200 μL de enzima. **8. Cuestiones
- Describe la reaccion que se está midiendo en esta práctica.** La reacción que estamos midiendo es la hidrólisis de los triglicéridos, estos se hidrolizan en glicerol y ácidos grasos.
10. Bibliografía Moyano, F. (20/10/2009) “ Composición y método cinético de la activación de la lipasa ” Lugar de pubicación: Google patents https://patents.google.com/patent/WO2011101499A1/es Sinisterra, J y Alcántara A. (Marzo de 1996) “Estudio de la actividad y enantioselectividad de derivados de la lipasa de Rhizomucor miehel.” Lugar de publicación: Universidad Complutense de Madrid. http://webs.ucm.es/BUCM/tesis//19911996/D/1/AD1027101.pdf