¡Descarga Métodos: Absorción, Espectroscopía, Cultivos Celulares y Muestreo - Prof. Bañuelos Calvo y más Apuntes en PDF de Biología solo en Docsity!
MÉTODOS
1.ABSORCIÓN ( Métodos de Detección y Cuantificación)
- Espectroscopía: Conjunto de técnicas analíticas, basadas en la interacción de la radiación electromagnética con la materia, que se usan para detectarlas moléculas, cuantificarlas y estudiar su estructura. -Radiación electromagnética: Combinación de campos eléctricos y magnéticos oscilantes, que se propagan a través del espacio, transportando energía.
Energía (E) = h ·ν = h ·( c /λ) Intensidad (I)=k/E^ Dualidad corpúsculo-onda:I = f(nº. fotones/segundo)
-Espectro electromagnético:
- Luz es la parte del espectro visible al hombre.
- Por extensión, se llama luz ultravioleta o infrarroja.
- Hablamos de velocidad de la luz para referirnos a la velocidad con que se propagan las radiaciones electromagnéticas en general.
-Interacción radiación-materia: Cuando la luz incide en la materia esta interacciona con las moléculas las cuales pueden dispersar y/o absorberla.
- Absorción de la luz: La energía de la luz absorbida excita a los electrones de las moléculas, los adquieren la posibilidad de pasar de su orbital molecular de equilibrio a uno más energético. Se produce entonces un tránsito electrónico.
*Cromóforo : parte de una molécula capaz de absorber luz al experimentar tránsitos electrónicos.
Los tránsitos (σ−σ*) requieren mucha energía y se producen cuando las moléculas son iluminadas con radiación UV muy energética (de vacío). No se emplean para la detección/cuantificación de biomoléculas.
Los tránsitos de baja energía (π−π* y n −π*) son los que experimentan los cromófors con dobes enlaces y pares electrónicos no compartidos (heteroátomos).
Solo se absorben las radiaciones con una longitud de onda adecuada para ΔE entre dos niveles de energía electrónicos. Se absorbe un fotón por cada tránsito electrónico que se produce. No todas las transiciones posibles son igualmente probables. A mayor probabilidad de tránsito, mayor absorción.
- Cuantificación de la absorción:
Transmitancia (T)=I/I_0 x100% (en porcentaje)
Ley de Lambert-Beer: T=10^(- ε·C·l) Log(I_0/I)= ε ·C·l =A (Absorbancia)
Ε=Χοεφιχιεντε δε εξτινχι⌠ν μολαρ (Μ⊥− 1 Ξ χμ⊥−1) “Absorbancia de una disolución 1M de un cromóforo,
medida con un paso óptico de 1cm”
C=Concentración del soluto en la disolución, en unidades molares.
L=Paso óptico. Espesor de la disolución, en cm.
Si no se conoce el peso molecular del cromóforo, sus concentraciones no se podrán expresar en unidades molares, por lo que:
Velocidad de propagación (c)= 300. Km/s
Longitud de onda (λ) se expresa en nm.
Frecuencia (ν) se expresa en Hz (s-1)
c = λ·ν
E= Amplitud
A= E^(0.1%)·c·l
C=concentración en mg/ml.
l= paso óptico en cm.
E^0.1%: coeficiente de extinción, cuyo valor es la Absorbancia de una disolución del cromóforoa 1 mg/ml, medida con un paso óptico de 1cm.
A disolución=A soluto+A disolvente
-Espectro de absorción de moléculas:
E= E electrónica + E vibracional + E rotacional
El espectro de absorciones característico de casa cromóforo, pues refleja su estructura y el entorno que le rodea.
El coeficiente de extinción informa sobre la probabilidad de tránsito a cada longitud de onda.
2.BÚSQUEDA BIBLIOGRÁFICA
Es bueno realizar una búsqueda bibliográfica ya que desde el principio de la historia la principal fuente de conocimiento reside en los libros. Hasta los temas más novedosos han sido tratados anteriormente por un adelantado a su época. Hay que estar continuamente actualizado y desde el último paso dado del último que estudió algo relacionado con tu área. Hay que conocer los buenos trabajos científicos.
Los motivos para realizar una búsqueda bibliográfica es un trabajo de grupo, científico, informes técnicos, autonomía en el aprendizaje. Dependiendo del tipo de trabajo profundizaremos más o menos.
-Fuentes de información:
Transición más probable
El espectro de absorción nos dice que la absorbancia es función de λ:
A=f(λ) A= ε ·C·l ε = f(λ)
λλAmax(nm)
Las partículas se desplazarán con movimiento acelerado, friccionando con e disolvente, hasta alcanzar una velocidad, v, tal que las fuerzas e fricción contrarresten la fuerza neta de sedimentación.
Svedberg M=(RxTxs)/(Dx(1-v parcial x d))
- Ultracentrífugas:
- Analíticas: Sistema óptico para el seguimiento durante la sedimentación. Poco volumen de muestra.
- Preparativas: No sistema óptico. Grandes volúmenes de muestra.
-Rotores:
- Angulares (con mucho ángulo), verticales (sin ángulo), casi-verticales (con poco ángulo).
- Flotantes, zonales, de flujo continuo.
-Centrifugación:
Fraccionamiento subcelular mediante centrifugación diferencial:
1º) Núcleos: ADN, laminas, mucleósido-trifosfatasa.
2º) Fracción mitocondrial: SDH, mitocondrias, lisosomas, peroxisomas.
3º)Microsomas: vesículas heterogéneas (membrana plasmática, r. endoplasmático, ap. De Golgi)
4º)Ribosomas libres: ARN. El sobrenadante final es el citoplasma soluble.
-Centrifugación zonal:
a) Formación del Gradiente
b) Aplicación de la muestra.
c) Centrifugación en rotor flotante.
d) Elución del tubo de centrífuga y fraccionamiento.
- En gradiente de densidad preformado: separación por diferencias de “s”, tamaño.
- En gradiente de densidad autogenerado (centrifugación isopícnica): separación por diferencias de densidad.
*La muestra a separar se disuelve en una disolución homogénea de una sal pesada (ej.: CsCl), la cual, por la acción del campo centrífugo, se redistribuye en un gradiente de concentración (más denso en el fondo del tubo). Los componentes de la mezcla se desplazan y concentran en la posición del gradiente autogenerado donde la densidad de la sal pesada es igual a su propia densidad. Se alcanza una situación de equilibrio.
4/5.CULTIVOS CELULARES:
El cultivo celular es el proceso mediante el cual células aisladas de un organismo se mantienen en condiciones controladas que permiten su supervivencia y crecimiento.
- Ventajas del cultivo celular: Los cultivos celulares son esenciales en la investigación científica, ya que permiten estudiar los procesos que ocurren en las células, y en diversas aplicaciones de biotecnología, como la producción de moléculas de interés industrial, ingeniería de tejidos, etc.
- Se puede disponer de células un tipo específico con propiedades homogéneas, mientras que los tejidos se componen de distintos tipos celulares.
- Se pueden obtener colonias de muchas células genéticamente idénticas a partir de una célula única: Clonación celular. La cepa de células resultantes se denominan: clon.
- Las condiciones experimentales pueden controlarse mejor en un cultivo que en un organismo intacto.
-Desventajas del cultivo celular:
- Las actividades fisiológicas en células cultivadas no están reguladas por otros tipos celulares o tejidos.
- Debido a que el ambiente inmediato de las células cultivadas difiere radicalmente de su ambiente norma, sus propiedades se ven afectadas de diversas formas.
Consecuencia: Las conclusiones obtenidas en experimentos con células cultivadas no siempre pueden extrapolarse a células en su ambiente normal, especialmente si forman parte de tejidos complejos en organismos pluricelulares.
-Factores a considerar en el cultivo celular (cultivo in vitro):
- Técnica aséptica: procedimientos utilizados para reducir o eliminar las contaminación por microorganismos de los medios de cultivo in vitro.
- Medios de cultivo: Deben suministrar los nutrientes esenciales para la supervivencia y crecimiento de las células en cultivo. En los cultivos que requieren diferenciación de células en tejidos, órganos, incluso en organismos completos requieren la adición de hormonas o factores de crecimientos. *Subcultivo: pasaje de células, tejidos, órganos, etc. Desde un medio de cultivo agotad a otro medio fresco.
- Condiciones ambientales: Temperatura, pH, oxígeno, luminosidad, humedad…hay que reproducir las condiciones ambientales naturales.
-Cultivo de microorganismos:
- Objetivos:
- Identificación de microorganismos en una muestra.
- Estudio de un microorganismo en particular.
- Clonación de genes mediante la tecnología del ADN recombinante.
- Producción de sustancias de interés (antibióticos).
■ Selectivo-diferenciales: combinan ambas características.
■ Enriquecidos: permiten aislar un tipo determinado de micro. A partir de una población mixta de gran tamaño.
- Obtención de cultivos puros o axénicos: los micro. viven en comunidades en su ambiente natural.
- Método de siembra por agotamiento de asa en placa para obtención de cultivos puros.
- Morfología de las colonias bacterianas: La morfología depende de la forma, borde, elevación y superficie. El carácter taxonómico se utiliza para la identificación de micro.
-Cultivo de células animales:
■ Objetivos:
- Mantenimiento de células, tejidos animales u órganos in vitro.
- Preservar y mantener sus propiedades fisiológicas, metabólicas y genéticas.
■ Aplicaciones:
- Aprovechar la maquinaria celular para estudios sobre metabolismo, regulación génica y fisiología.
- Trasplante de órganos y tejidos.
- Clonación.
- Producción de proteínas recombinantes.
■ Factores a considerar en el cultivo in vitro de células animales:
- Manejo de cultivos de cabina de flujo laminar, uso de mascarilla y guantes para proteger tanto al cultivo como a la persona que lo maneja.
- Medios de cultivo: aminoácidos esenciales (cisteína, leucina), vitaminas (colina, folato), ácidos grasos, penicilina, péptidos y factores de crecimiento proteicos (aumentan el índice de actividad mitótica y síntesis de ADN facilitando la proliferación celular) que permitan la diferenciación celular, frecuentemente provistos en forma de suero.
- Condiciones de incubación: 37ºC en una atmósfera de 5% de CO2, 95% aire. La mayoría de las células de vertebrados crecerán sólo cuando estén adheridas a un sustrato cargado negativamente revestido con componentes de la matriz extracelular en su medio natural.
■ Soportes para el cultivo de células animales:
- Líquido: células en suspensión. Botellas rodantes (rollers).
- Sólido: células adheridas a vidrio o distintos tipos de materiales sintéticos (policubetas, frascos estáticos)
■ Soportes recubiertos para favorecer la adhesión celular:superficies de placas o frascos recubiertas con componentes de la matriz extracelular (proteínas) para aumentar la adhesión y proporcionar señales para el crecimiento.
■ Morfología de las células en cultivo:
- Tipo epitelial: en monocapa con aspecto aplanado y forma poligonal.
- T. linfoblástico: en suspensión con forma esférica.
- T. fibroblástico: en monocapa con aspecto alargado y bipolar.
■ Establecimiento de cultivos celulares:
- Cultivos primarios: los preparados directamente a partir de un tejido u órgano.
- Cultivos secundarios: Las células se dividen hasta formar una monocapa.
Las cepas celulares derivadas de cultivos primarios tienen un periodo de vida limitado. Las líneas celulares proliferan indefinidamente con un cultivo apropiado.
-Cultivo de plantas:
■ Cultivo de tejidos vegetales in vitro: comprende un heterogéneo grupo de técnicas mediante las cuales un explante (cualquier parte de la planta) se cultiva bajo condiciones asépticas en un medio de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas.
■ Aplicaciones: estudios básicos de fisiología, genética, bioquímica; bioconversión y producción de compuestos útiles; incremento de variabilidad genética; obtención de plantas libres de patógenos; progpagación de plantas y conservación e intercambio de germoplasma.
■ Tipos de cultivo: Cultivo de células, de tejidos, de órganos y de protoplastos. Para el cultivo de tejidos se necesita situar un explante en condiciones asépticas en un medio apropiado para que las células expresen su potencialidad.
■ Conceptos básicos:
- Totipotencia: Es la capacidad de una células vegetal de dar lugar al desarrollo de una planta completa. Las células totipotentes son células que han retenido su capacidad de dividirse y diferenciarse en una planta madura si se colocan en el medo adecuado.
- Desdiferenciación/rediferenciación celular:
■ La desdiferenciación consiste en la transformación y pérdida de las características de especialización de un tipo celular para dar lugar a células de tipo meristemático.
■ La rediferenciación de las células previamente desdiferenciadas es el siguiente paso en la regeneración de una planta.
- Balance de reguladores del crecimiento vegetal: Todo proceso de diferenciación está regulado por el balance entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento fundamentalmente auxinas (ácido naftalenacético) y citoquininas (zeatina). Es importante la secuencia de hormonas utilizadas y el tiempo de permanencia de cada una.
6.DISEÑO DE MUESTREO
-Fases de un trabajo de campo : 1ª imagen BÚSQUEDA BIBLIOGRÁFICA
-Aspectos clave en el diseño del muestreo: Programa de muestreo y/o experimentación, DISEÑO MUESTRAL.
■ Aspectos clave: Idea---Concretar la idea en una hipótesis---Adecuación del diseño muestral a la hipótesis--- Resultados---Discusión
- Idea o detección de un problema: El científico debe tener una actitud crítica y curiosa que le permita detectar lagunas en el conocimiento. Realizará una observación directa que se llevará a cabo en el campo y una información previa a base de estudios, publicaciones,revistas…)
Electroforesis:
-Las biomoléculas tiene en su mayoría carga eléctrica.
-En presencia de campo eléctrico se desplazarán, con mayor o menor velocidad, y , por tanto, mayor o menor movilidad electroforética, en función de su carga neta, su tamaño y su forma, lo que permitirá separar a unas de otras.
-La separación se realiza en modalidad zonal: electroforesis zonal
-La separación no se suele llevar a cabo en medios fluidos, sino en medios semisólidos, llamados geles, los cuales actúan como estabilizadores de las zonas o bandas.
No se puede hacer un tratamiento teórico exacto del transporte en campos eléctricos porque la atmósfera iónica introduce complicaciones sin solución matemática.
-Geles de electroforesis: estado coloidal (semisólido) en el que la fase dispersante está formada por polímeros fibrilares ( poliacrilamida o de agarosa ) entre cuyas fibras entrelazadas queda retenida, por capilaridad e hidratación, la fase dispersa de naturaleza acuosa. La gelificación se consigue, mediante una reacción de polimerización (geles de poliacrilamida) o promoviendo el paso de sol a gel por calentamiento del primero (geles agarosa).
- Porosidad del gel. Reticulado: cuanto mayor sea la concentración de fibras y su grado de entrecruzamiento, menor será la porosidad (mayor el reticulado) del correspondiente gel. El % de acrilamida determina el reticulado del ge resultante.
El agente de entrecruzamiento, bis-acrilamida, se emplea en pequeñas proporciones, para asegurar la dureza y consistencia del gel final. Terminada la polimerización se puede “desmoldar”.
La agarosa se disuelve en caliente en disolventes acuosos, alcanzando un estado coloidal de sol. Al enfriarse pasa al estado e gel. Entonces se puede “desmoldar”. La concentración de agarosa en la disolución inicial determina el reticulado final del gel.
- Electroforesis de ácidos nucleicos: Todas las moléculas de ADN tienen la misma relación carga/tamaño, y, si hablamos de DNA de doble hélice, todas tienen la misma forma. Las moléculas de ADN encuentran mucha viscosidad en su avance a través de la agarosa. El reticulado del gel actúa como un verdadero tamiz molecular, restringiendo el avance de las moléculas. El gel de agarosa es un soporte restrictivo para estos ADNs. Con geles de muy baja concentración de agarosa no se da este efecto tamizado molecular, soporte no restrictivo.
ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN:
Animales que se emplean para fines científicos, de ellos podemos obtener beneficios y conocimiento. Sirven para: la investigación básica, elaboración productos farmacéuticos, estudios biologicos, investigación medica y vterinaria, modelos quirurjicos, ensayos de fármacos, estudios de desarrollo embrionario, clonación y dscubrimiento de antibióticos
Es importante el bienstar de los animalesen sus aspectos físicos y psicológicos, confort ambiental, sin dolor i estrés, interaccion social, sin procedimientos estresantes, ni mala manipulación, responsabilidades legales y morales.
Tipos de animales de experimentación en investigaciones biomédicas:
-Invrtebrados (menos costosos y un ciclo de vida que proporciona rapidez en los resultados. Ej: Drosophila melanogaster (mosca del vinagre).
-3Rs: (Reducción, Refinamiento y reemplazo)Pautas la investigación y experimentación.
W. Russel y R.Burchen 1959: diejron que se debía tartar a los animales de forma humanitaia, conservando su bienestar:
- Reducir: el nº de animales, sinhacer un gasto excesivo pero que siga siendo una posible estadística.
-Refinamiento: trato adecuado y humanitario, anestesias.
-Reemplazar: a los animaessiempre que sea posible,por otros métodos.
Legislacion: DirectivaEuropea
-Claculo del tamaño muestral, evitar duplicaciones realizando búsquedas bibliográficas, recursos no organicos, no reutilización, usar estudios compartidos.
-Evitar pruebas de estrés,para procedimientos invasivos su usan anesgtesia y analgesia y personal cualificado.
-Usar basterias, algas y ohmngos, invertebrados, embriones(animalescon poco desarrollodel sistema nervioso),
Reemplazo absoluto: usar modelos matemáticos informaticosReemplazo ralativo: métodos in vitrocultivos celulares.
