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estudio e identificacion mcirobiologica
Tipo: Apuntes
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DEL GÉNERO Salmonella EN UNA POBLACIÓN DE C rocodylus intermedius Y TESTUDINOS MANTENIDOS EN CAUTIVERIO EN LA ESTACIÓN DE BIOLOGIA TROPICAL ROBERTO FRANCO E.B.T.R.B DE LA FACULTAD DE CIENCIAS – UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA EN VILLAVICENCIO – META
DEL GÉNERO Salmonella EN UNA POBLACIÓN DE C rocodylus intermedius Y TESTUDINOS MANTENIDOS EN CAUTIVERIO EN LA ESTACIÓN DE BIOLOGIA TROPICAL ROBERTO FRANCO E.B.T.R.B DE LA FACULTAD DE CIENCIAS – UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA EN VILLAVICENCIO – META
Presentado como requisito parcial Para Optar el Título de
Microbiólogo Agrícola y Veterinario
DEL GÉNERO Salmonella sp_._ EN UNA POBLACIÓN DE C rocodylus intermedius Y TESTUDINOS MANTENIDOS EN CAUTIVERIO EN LA ESTACIÓN DE BIOLOGIA TROPICAL ROBERTO FRANCO E.B.T.R.B DE LA FACULTAD DE CIENCIAS – UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA EN VILLAVICENCIO – META
Bact. MS.c. Adriana Pulido Villamarín MV. Carlos Alfonso Moreno Torres Director. Revisor Consultor Pontificia Universidad Javeriana. Universidad Nacional de Colombia
MV. MS.c. Rubiela Castañeda Salazar Biol. PhD. Julio Mario Hoyos Hoyos Jurado Jurado Pontificia Universidad Javeriana. Pontificia Universidad Javeriana.
DEL GÉNERO Salmonella sp_._ EN UNA POBLACIÓN DE C rocodylus intermedius Y TESTUDINOS MANTENIDOS EN CAUTIVERIO EN LA ESTACIÓN DE BIOLOGIA TROPICAL ROBERTO FRANCO E.B.T.R.B DE LA FACULTAD DE CIENCIAS – UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA EN VILLAVICENCIO – META
INGRID SCHULER., Ph.D Bact. M.SC., M Ed. Janeth Arias P. Decana Académica Directora Facultad de Ciencias Carreras de Microbiología
A la Dra. Adriana Pulido Villamarín, por haberme dado la confianza para la realización de este proyecto, por su dedicación, compromiso y apoyo incondicional, aportando todos sus conocimientos para la realización de este trabajo.
Al Dr. Carlos Moreno Torres por el aporte de sus conocimientos y constancia para concluir con éxito este trabajo.
Al laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia, a su directora Dra. Judith Figueroa Ramírez y Dra. Derly Fierro Toscano por haberme dado la oportunidad de trabajar en sus instalaciones, ya que sin su colaboración esto no hubiera sido posible.
Agradecimiento especial a Becton Dickinson LTDA por la dotación de medios de cultivo, kit de identificación y sensidiscos.
A todo el personal de la Estación de Biología Tropical Roberto Franco por toda su colaboración y especialmente a su directora profesora María Cristina Ardila por sus aportes al trabajo.
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Tabla Nº 1. Propiedades bioquímicas diferenciales de las subespecies de Salmonella sp. 34
Tabla Nº 2. Resultados de las pruebas bioquímicas clave para la identificación de microorganismos pertenecientes al género Salmonella sp. 37
Tabla Nº 3: Especies de Crocodylia y Testudines muestreadas y número de cepas de Salmonella sp. aisladas para cada especie según estanques muestreados 55
Tabla Nº 4: Comportamiento de los microorganismos del género Salmonella sp. aislados a partir de muestras de ejemplares de Orden Testudinata frente a los antibióticos utilizados mediante el método de Kirby – Bauer 77
Tabla Nº 5: Comportamiento de los microorganismos del género Salmonella sp. aislados a partir de muestras de ejemplares de Orden Crocodylia frente a los antibióticos utilizados mediante el método de Kirby – Bauer. 78
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Figura Nº 1. Septicemia por Salmonella sp. en Crocodylia 46
Figura Nº 2. Septicemia por Salmonella sp. en Testudinos 46
Figura Nº 3. Caimán del Orinoco o Caimán Llanero ( C. intermedius ) 48
Figura Nº 4. Ejemplares de Orden Testudinata encontrados en la E.B.T.R.F 49
Figura Nº 5. Toma de muestras: hisopados cloacales en Testudinos. 56
Figura Nº 6. Muestreo de ejemplares neonatos de Crocodylus intermedius mediante hisopado cloacal. 57
Figura Nº 7. Muestreo de agua y sedimento de los estanques. 58
Figura Nº 7A y 7B. Muestreo en los estanques de Crocodylia neonatos y Testudinos 58
Figura Nº 7C Muestreo en estanques de Crocodylia Adultos y Juveniles 58
Figura Nº 8. Muestreo de arena y materia fecal encontrada en los encierros de los animales en estudio. 59
Figura Nº 9. Identificación de colonias compatibles con Salmonella sp. en medios de cultivo selectivos. 60
Figura Nº 9 A. CRHOMagar Orientación 60
Figura Nº 9 B. Agar MacConkey 60
Figura Nº 10. Características morfológicas de las enterobacterias del género Salmonella sp. aisladas en los medios de cultivo diferenciales. 61
Figura Nº 10 A. CHROMagar Salmonella. 61
Figura Nº 10 B. Agar Hektoen Entérico. 61
Figura Nº 11. Microorganismos diferentes a Salmonella sp. aislados en las muestras. 62
Figura Nº 11 A. Staphylococcus saprophyticus. 62 Figura Nº 11 B. Escherichia coli. 62 Figura Nº 11 C. Enterococcus sp. 62 Figura Nº 11 D. Klebsiella sp. 62 Figura Nº 11 E. Citrobacter sp. 62
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Figura Nº 29: Microorganismos aislados en las muestras de hisopados cloacales de ejemplares de C. intermedius muestreados. 83
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ANEXO N º 1. Plano de la E.B.T.R.F 106
ANEXO Nº 2. Apariencia de los microorganismos en CHROMagar Orientación 107
ANEXO Nº 3. Sistema de Identificación BBL Crystal para Entericos/No Fermentadores. 108
Anexo 3.1. Procedimiento para la identificación de los microorganismos por sistema BBL Crystal. 108
Anexo 3.2. Ficha técnica de reacciones de color para lectura de resultados. 109
Anexo 3.3. Calculo del número de perfil 109
ANEXO Nº 4. Esquema de Kauffmann – White 110
ANEXO Nº 5. Interpretación de pruebas de sensibilidad a antimicrobianos 112
ANEXO Nº 6. Resultados obtenidos por estanque en cada muestreo. 114
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Salmonella sp. has been reported as pathogens for human and animals domestic as wild; in spite of being part of the normal intestinal flora of reptiles especially of turtles. The Estación de Biología Tropical Roberto Franco located in the city of Villavicencio is part of the Universidad Nacional de Colombia, and it leads the program of recovery of the Caiman Llanero ( Crocodylus intermedius) , which is in imminent extinction danger and also bill with an alive collection of Testudinos of different families.
With the purpose of evidencing the presence of the enteropathogen, we proceeded to isolate microorganisms of the gender Salmonella sp. starting from samples of environmental and cloacae origin using the standard methodology; we proceeded to serotyping the isolations for the conventional method of Kaufmann-White and finally we did an antimicrobial susceptibility test for each strain found in the Estación.
Results reports a prevalence of 52% of Salmonella sp in the population sampled with a bigger detection starting from samples of water/silt. Antimicrobial susceptibility test could determine than 100% of the isolates were sensible to norfloxacine. Knowing that microorganism of serogroup C2 were the most prevalent (41,4%) and aware of the zoonotic risk we begin to the implementation of a biosecurity manual for the Estacion and this way to prevent all risk for the animal and human population.
Results going to strength programs of animal sanity that seek to guarantee the health of the animals and to carry out new in investigation in pathology, nutrition, etiology and genetics.
Los miembros del género Salmonella están ampliamente distribuidos en la naturaleza, se encuentran como comensales y patógenos en el tracto gastrointestinal de mamíferos domésticos y salvajes, reptiles, aves e insectos, causando un amplio espectro de enfermedades en sus hospederos, considerándose como la principal enterobacteria de importancia en salud pública (^) (Selbitz et al., 1995. Turnbull, 1979). Para el caso de Latinoamérica y especialmente para Colombia la investigación acerca de microorganismos pertenecientes al género Salmonella se ha centrado en relación con las enfermedades trasmitidas por agua y por alimentos (ETA) y es poco lo que se ha investigado con respecto a la transmisión por reptiles donde esta enterobacteria hace parte de la flora intestinal normal; a pesar que las autoridades reguladoras del medio ambiente reconocen el problema zoonótico que representan las especies silvestres frente a la población humana, las investigaciones en el área biológica y veterinaria son insuficientes (^) (Hernández, 2004)
Los reptiles frecuentemente son portadores asintomáticos de Salmonella sp. y por consiguiente, los casos clínicos de salmonelosis son reportados con menor frecuencia (Ramsay, et al , 2002). Sin embargo, numerosos estudios han^ asociado^ la bacteria con altos niveles de mortalidad en serpientes y tortugas, y a su vez, un gran porcentaje de investigaciones han implicado la herpetofauna en la transmisión de Salmonella sp. hacia los humanos, lo cual permite establecer la capacidad de generar procesos de infecciones zoonóticas y la importancia de la bacteria a nivel de salud pública (^) (Saelinger y Lewbart , 2006).
De manera natural los reptiles son susceptibles a enfermedades que contribuyen a la disminución de las poblaciones; aunque en la mayoría de los casos se desconoce la acción patógena de los microorganismos sobre estas especies silvestres, ignorándose el impacto que tienen las enfermedades bacterianas sobre las mismas, así como el tratamiento ideal para combatir los signos producidos (^) (Mader, 1996). Sin embargo, es de vital importancia tener en cuenta que la presencia de éste tipo de endopatógenos no se asocia necesariamente con estados de enfermedad (^) (Lax, et al. , 1995). Desde el punto de vista profiláctico, la susceptibilidad a patologías causadas por enterobacterias en reptiles se relaciona con estados de depresión en el animal, que pueden producirce a causa del estrés por el cautiverio, alteración en temperaturas medioambientales, el número de microorganismos presentes, edad, estado nutricional del animal, entre otras (^) (Mader, 1996). Los resultados asociados a este tipo de condiciones son la afección de tejidos y fluidos por generar un bloqueo de los vasos sanguíneos, edema, ulceraciones, necrosis,
La familia Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), pertenece al orden XIII Enterobacteriales. Según la segunda edición 2001 del Manual Bergey de Bacteriología Sistemática, está conformada por 41 géneros y más de 100 especies (^) (Quinn et al., 2002), aunque menos de la mitad tienen interés desde el punto de vista veterinario (^) (Stanchi, 2007). Su hábitat natural es el intestino y muchos de estos microorganismos provocan enfermedades tanto en los animales productores de alimentos (diarrea de los recién nacidos y salmonelosis), como en los animales de compañía (infecciones y abscesos del tracto urinario) y en el hombre (^) (Biberstein, y Chung Zee , 1990). Esta familia incluye géneros de gran importancia a nivel epidemiológico como son Escherichia coli, Shigella sp. , Salmonella s p, Enterobacter sp. , Klebsiella sp. , Serratia sp. , Proteus sp. , Citrobacter sp. , Edwarsiella sp. , Yesinia sp., Morganella sp. , y Arizona sp. entre otras (^) (Jawetz, et al , 2005).
Los microorganismos de esta familia son parecidos en cuanto a su morfología y caracteres tintoriales por ser bacilos pleomórficos Gram negativos y asporógenos de un tamaño de 2 – 3 μm por 0,4 – 0,6 μm, catalasa positivos y oxidasa negativo, por carecer de citocromo c, lo cual es una propiedad bioquímica útil en el aspecto diagnóstico de la familia (^) (Stanchi, 2007; Biberstein y Chung Zee , 1990). Los representantes de este grupo de microorganismos son anaerobios facultativos; en condiciones anaerobias, su crecimiento depende de que en el medio existan carbohidratos como fuente de carbono; en aerobiosis, la gama de sustratos apropiados para su crecimiento incluye ácidos orgánicos, aminoácidos y carbohidratos (^) (Biberstein y Chung Zee , 1990). Mediante observación microscópica resulta difícil diferenciar los representantes de un determinado género de los pertenecientes a los demás géneros. Son clave para el diagnóstico los productos resultantes de la fermentación de azúcares; casi todos los microorganismos de este grupo fermentan la glucosa a ácido pirúvico por la vía de Embden Meyerhoff (glicolisis); fermentan la D-glucosa a menudo con producción de gas, reducen los nitratos a nitritos y poseen un contenido de DNA del 39 al 59% de guanina mas citosina (G+C), algunos poseen cápsula (^) (Stanchi, 2007; Biberstein y Chung Zee , 1990). Las propiedades que definen a la familia deben ponerse en evidencia para afirmar que la cepa es una enterobacteria. A partir de ahí se realiza la identificación, fundamentalmente por las características bioquímicas para estudiar el metabolismo proteico (presencia de ureasa, producción de indol, degradación del triptófano), el metabolismo glucosídico (fermentación de azúcares: glucosa, lactosa, sacarosa, etc.), la capacidad de utilizar el citrato como única fuente de carbono, la presencia de enzimas descarboxilasa y
desaminasas y la producción de hidrógeno sulfurado, entre las características más importantes (^) (Biberstein y Chung Zee , 1990). Las Enterobacterias pueden comportarse como apatógenas, patógenas oportunistas y patógenas importantes. Las primeras, pueden encontrarse como contaminantes de muestras clínicas, siendo aisladas del ambiente y/o materia fecal, como es el caso de Hafnia ; las enterobacterias patógenas oportunistas ocasionalmente producen enfermedad a nivel del tracto digestivo, mientras que las patógenas importantes pueden causar daños entéricos y sistémicos, por poseer una estructura antigénica compleja y producir varias toxinas y otros factores de virulencia (^) (Baümler et al. 1998, Muñoz et al, 2002, Biberstein y
Chung Zee , 1990).
2.2. El Género Salmonella El género Salmonella recibe su nombre en honor al microbiólogo americano Daniel Elmer Salmon (1850-1914), quien en 1876 fue reconocido como el primer doctor en medicina veterinaria graduado en una universidad de los Estados Unidos. Junto a Theobald Smith (1859-1934), conocido por su trabajo con anafilaxis, fueron quienes descubrieron los gérmenes designados como salmonelas, en 1885, aislándolos de cerdos con cólera (^) (Stanchi, 2007)
Salmonella sp. es la enterobacteria de mayor importancia a nivel de salud pública por producir trastornos del tracto gastrointestinal y septicemia no solo en el ser humano, sino en todas las especies animales (^) (Selbitz et al; 1995; Turnbull, 1979, Lujan y Blas, 2007)
Los microorganismos del género Salmonella están extensamente diseminados en la naturaleza como comensales y como patógenos del aparato digestivo de los mamíferos domésticos y silvestres, aves, reptiles e insectos, en los cuales pueden llegar a producir una amplia gama de enfermedades. Todas las salmonelas son potencialmente patógenas (^) (Stanchi 2007; Smith et al. 1952; Mahajan et al. 2003) al ser parásitos intracelulares y por medio de los macrófagos en los que se encuentran, se diseminan por todo el organismo afectado aprovechando la vía linfática y sanguínea (^) (Smith et al. 1952; Suter, 1956; Stanchi, 2007). En medicina humana están descritas diversas presentaciones de salmonelosis: fiebre entérica, septicemia, y finalmente gastroenteritis; mientras tanto, en medicina veterinaria se ha determinado que esta bacteria puede provocar septicemia, enteritis aguda, subaguda y crónica, y abortos en diferentes especies animales (^) (Stanchi, 2007). Las diversas especies de salmonelas se transmiten por contacto tanto con enfermos como con portadores sanos, aunque por lo general la enfermedad producida por este agente microbiano tiene un origen alimentario debido a la ingesta de alimentos contaminados
