¡Descarga MGO. Tema 2 y más Apuntes en PDF de Biotecnología solo en Docsity!
Tema 2.-Ampliació tècniques manipulació genètica
PCR ens serviria per a quantificar DNA o RNA? La quantitativa serviria, però la PCR normal no quantitativa no ens serviria.
Tenim maneres d’aconseguir PCRs quantitatives o semiquantitatives mitjançant les etapes.
La PCR ha tingut un gran impacte en la biologia molecular:
- Amplificació de seqüències de DNA específiques per un factor enorme:
- Diagnòstic prenatal i medicina forense
- Permet introduir una seqüència extra a la seqüència que es pretén amplificar
- permet amplificar el cDNA que correspon a missatgers poc abundants (RT-PCR) Va permetre caracteritzar gens que s’expressaven a baixos nivells com per ex. Factors de transcripció que per les tècniques de clonació clàssiques no es podien trobar. F 0 E 0gran impacte en el coneixement dels processos biològics
La quantificació de DNA o RNA per Southern o Norther n blots es pot fer mesurant la intensitat de banda, però no són mètodes gaire sensibles. En general quan més molècules hi hagi en la mostra inicial, més molècules estaran presents a cada pas d’amplificació. Mesurant el producte final de la PCR en un gel es pot tenir una idea de quanta molècula inicial estava present al començament de la reacció.
No obstant això no és del tot fiable perquè: Si la quantitat de “primers” i nucleòtids és massa baixa o hi ha massa cicles de PCR F 0 E 0Els “primers” i nucleòtids de la reacció s’hauran acabat i la reacció assolirà un plateau a partir del qual no es pot obtenir més producte.
fases de la PCR applied
La fase exponencial és la més eficient de totes, és en la que ens fixem a les PCR quantitatives. La fase lineal no es dobla el producte en cada cicle, i ja s’ha perdut eficiència. La plateau per molt que seguim fent els cicles ja no hi haurà més amplificació de DNA.
Quan pensem en la PCR convencional : una vegada acabem la PCR ho carreguem en un gel d’agarosa. En PCR a temps real analitza la quantitat de producte en cada cicle d’amplificació
un cop finalitzat mirem com evoluciona al llarg de les fases i sobretot ens fixarem en la fase exponencial.
Hi ha varis mètodes per determinar la quantitat de producte d’amplificació en cada cicle, però tots es basen en la quantitat de fluorescència associada amb cada nova molècula sintetitzada. El bromur d’etidi o el SYBR Green s’intercala en la doble cadena de DNA, es fan
servir coma fluorocroms. Per tant, representant l’augment de fluorescencia en cada cicle
és possible analitzar la cinètica de la PCR a temps real:
representació Real time nombre cicles versus fluorescencia
Sifixem el llindar a 100.000 per exemple. Quan fem amplificació de les mostres, mirem en quin valor / moment del cicle, la teva amplificació passa el llindar. En la foto: 23,2.
Es fixa un llindar de fluorescència que està per sobre de la línia base o el soroll de fons de fluorescència. El Ct (threshold cycle) : nombre de cicles en els quals la fluorescència arriba al llindar de fluorescència.
Quan tenim vàries mostres, allà on tinguéssim el llindar ha de ser on estigui en fase exponencial. Una vegada el fixem, veiem que la mostra més concentrada tindria ct=27. La mostra més concentrada tindrà ct més baixos perquè superarà el llindar abans que la mostra més diluïda. A partir del cicle llindar podem calcular el DNA que teníem originalment.
E: eficiènciad’amplificacióImaginem que amb els aparells de Real time actuals cal 10 10 còpies
de producte de PCR per produir una senyal per sobre del “ background ”. Quan s’arriba al Ct, la reacció d’amplificació és descrita per l’equació:
Tn: quantitat deseqüències diana al cicle nT0: quantitat de seqüència inicial
N= cicle en el qual s’arriba al llindar de fluorescència o ct.
Tn=10exp10.
Si apliquem la fórmula, tenim una manera de trobar la quantitat de mostra inicial.
Eficiència en teoria és 2 però a la pràctica és una mica menys. 1,9. Degut a: Inhibidors de la PCR o Fragments de DNA que provoquen events inespecífics d’encebat que per casualitat tinguessis un tros de DNA que et fes d’encebador o Inapropiada selecció d’encebadors, sondes i amplicons.
Quan es vol comparar el nivell de missatger entre vàries mostres cal:
Si volem comparar el DNA de dues mostres que faríeu? El DNA no es degrada i per tant és fàcil. Però l’RNA es degrada molt fàcilment, a més s’ha de passar a cDNA.
Com podem assegurar-nos que el que estem analitzant al final és igual al que teníem originalment? Controls. Quins? El primer pas que hem de fer és comprovar la integritat del nostre RNA (que no s’ha degradat). I com ho fem? A través d’uns gels desnaturalitzant d’agarosa que ens desnaturalitza RNAasa i el RNA que el desplega per a poder-lo separar bé en els fragments que ha de tenir. El següent pas és síntesi de cDNA. Com ens podem assegurar que la síntesi de DNA a anat be en les dues mostres? Si tenim un gen constituïu que s’expressi a tots per igual, el podríem usar com a criteri per a normalitzar les mostres, per exemple la tubulina, etc. F 0 E 0gen housekeeping.
RTA= acumulació relativa de transcrit Control = persona sana Sample = persona malalta Target=diana
Una altra alternativa barata a PCR temps real. La PCR convencional no és quantitativa i en el millor els casos es semiquantitativa. Com podem aconseguir que la PCR semiconvencional sigui quantitativa? Es faria agafant alíquotes de la PCR a diferents cicles de la PCR. De manera que en aquest cas si que podem veure quan es comença a ampliar. (àudio) havíem de demostrar per una altra tècnica això era real i el que vam fer es triar 3 gens constitutius i fer amplificació de suro i de lleny. Es veu molt clar com els contitutius es comença a detectar l’actina al cicles aproximadament iguals a suro i a llenya. Això ens indica que tenim igual eficiència en els cicles. Amb els gens target (2 fotos de baix): el HCBT comença a detectar-se al 21 i al lleny al 27. detectem amplicó molt abans a suro que lleny. Això ens permet quantificar de forma semiquantitativa de si fem PCR convencional i no tenim a l’abast l’altre PCR. Ens pot donar indicis de com s’expressen els uns i els altres de forma aproximada
S’han d’usar fluoròfors que s’intercalin. Però això pot tenir un problema F 0 E 0que si hi ha un amplicó inespecífic, això no ho detectes. No diferenciaràs amplicó específic de l’inespecífic. El problema de cyber green s’intercala en qualsevol lloc. En PCR es pot donar dímers de primer (que els primers es poden aparellar entre ells i el cybergreen es podria unir allà i et donarà senyal també. La manera que tenim amb els aparells de real time per a veure si la reacció és específica seria quan ja has arribat a al saturació, fas una desnaturalització i aleshores, en funció de la cadena de DNA es desnaturalitzarà a una temperatura o una altra. Dos amplicons diferents no desnaturalitzaran a la mateixa temperatura. Llavors es fa una melitng curve. Si tens 2 amplicons el que passarà és que tindràs dues corbes.
Hi ha una altra possibilitat per assegurar-nos que el resultat és específic del nostre amplicó. Tenim:
- primer forward i reverse.
- Sonda fluorescent Quan s’aparella la sonda (sonda taqman), com que el fluoròfor i el quencher estan molt junts F 0 E 0no emet fluorescència, però quan hi ha extensió, el tq digereix la sonda taq i s’allibera fluoròfor al medi F 0 E 0a més fluorescència més amplicó. Avantatge sonda taquman : ens dóna molta especificitat. La instrumentació de la Real time ha estat desenvolupada de manera que combina cicles de temperatura amb mesura de fluorescència F 0 E 0Permet mesurar l’evolució de la PCR a temps real. Les reaccions es caracteritzen per trobar el punt en el qual l’amplificació comença a ser detectada, més que per detectar la quantitat de producte de PCR acumulat a un nombre de cicles determinat. Quan més gran sigui el nombre de còpies inicials F 0 E 0Més aviat es nota un augment significatiu en fluorescència Quantificació absoluta d’una molècula en una mostra desconeguda s’aconsegueix preparant una corba Standard usant diferents nombres de còpia de la seqüència diana.
Dos alternatives a les sondes Taqman:
1 220px-Molecular_BeaconsSNP-Molecularprobe-1.” Molecular beacons ”: tenen una
estructura de loop i fluoròfor i quencher encara estan més propers. La seqüència de la sonda és lo que tenim en blau a la imatge. Durant la desnaturalització, quencher i fluoròfor
quedaran separats, a més la sonda se’ns unirà a la cadena complementària. En el moment
d’anellament/hibridació, la quantitat de fluorescència serà proporcional a la quantitat
d’amplicó. F 0 E 0A la fase de desnaturalització, la fluorescència no serà proporcional a la
quantitat d’amplicó. En aquest cas la sonda és molt llarga al d’abans no.
(^2) ” Scorpion probes ”: Aquesta sonda té una seqüència 3’ que actua com a “primer” i és allargada en la reacció de PCR. Després de la desnaturalització, la seqüència de la sonda s’uneix a la seqüència diana i això restaura la fluorescència. Una avantatge de les sondes fluorescents és que poden usar diferents fluoròfors amb colors diferents F 0 E 0És possible determinar la quantitat relativa en base al color del fluoròfor.
S’usen promotors de fags perquè: , + Aquests promotors són molt forts, s’obtenen grans quantitats de RNA “in vitro”.
- El promotor del fag no és reconegut per l’RNA polimerasa d’E. coli i per tant, no es donarà transcripció dins la cèl·lula. + L’RNA polimerasa del fag com ara SP6, T7 i T3 són molècules més simples de manipular que els enzims d’E. Coli, ja que l’enzim actiu és un únic polipèptid.
Es veu Hind3 i Bamh1 F 0 E 0hi podem posar el nostre insert. S’ha de sintetitzar la cadena sentit i antisentit. Perquè creieu que és imp o quina avantatge té? Quan hem de fer un northern o hibridació in situ ens hem d’assegurar que no hi hagi cap tipus d’unió inespecífica. El sentit es fa servir com a control negatiu F 0 E 0estar segur que el que detectem és únicament degut al nostre RNAm.
Els vectors LITMUS tenen promotors T7 de l’RNA polimerasa a ambdós extrems: En aquest com podem fer la síntesi en un sentit i en l’altre. Quines alternatives tindríem per fer la síntesi sentit i antisentit? Amb enzims de restricció. Tot i tenir el mateix promotor (T7) en ambdós costats. En quins casos cal transcripció in vitro? F 0 E 0traducció o transcripció in vitro. Perquè ens pot servir? Fer traducció in vitro ens servia en un passat per a poder relacionar una seqüència de cDNA a una proteïna física.
What are small RNAs:
- Small RNAs are a pool of 21 to 24 nt RNAs that generally function in gene silencing
- Small RNAs contribute to post-transcriptional gene silencing by affecting mRNA translation or.. ------stability - Small RNAs contribute to transcriptional gene silencing through epigenetic modifications to chromatin
Dicers and Argonautes: RNA silencing uses a set of core reactions in which double-stranded RNA (dsRNA) is processed by Dicer and its homologues into short RNA duplexes. These small RNAs subsequently associate with members of the ARGONAUTE family of proteins to confer silencing. ARGONAUTE proteins bind small RNAs and their targets.
siRNA -mediated silencing via post-transcriptional and transcriptional gene silencing
MicroRNA -mediated slicing of mRNA and translational repression
Per aconseguir RNAi:
Ús d’una construcció que contingui adjacents el transgen sentit i antisentit per produir un “hairpin de RNA”
Com fem servir aquest sistema per a silenciar gens nosaltres? Les resistències a les plantes: es posava un fragment de RNA amb la resistècia a un virus i desencadenava RNAi. Estaven interessats en la formació de la flor. Van provar si podien aconseguir un fenotip idèntic al seu mutant fent servir RNAi com a model d’estudi.
Van fer servir el promotor del p35S del virus del mosaic de la coliflor. És el promotor d’un virus que infecta plantes. Aquest promotor quina funció té? Es constitutiu, s’expressa a totes les cèl·lules, i és molt fort. 1r. Posaven 2 missatgers antisentits i eren complementaris. La seqüència del mig serveix perquè es puguin plegar. 2n. Van incorporar p35S amb antisentit i un terminador. I després un altre promotor amb un ‘sentit’ i terminador. 3r. control: promotor fort amb antisentit. 4t. control: promotor fort amb sentit.
Sistemes d’expressió induïbleLa que donava un silenciament més potent era la (1), donava uns efectes més forts en quant a silenciament.
No obstant a vegades la proteïna recombinant és tòxica , alts nivells d’ expressió de forma constitutiva són letals.
És molt imp tenir molt clar quin gen posarem, però tambñe quin promotor farem servir. Els promotors els podem separar en 2 tipus:
- Constitutius: avatnatge que són forts
- Induïbles: avantatge que pots controlar.
Si volem induir una prot en una situació en concret fer servir promotors que només s’acumulin a les glandules mamaries, s’acumularia a la llet i és molt fàcil d’obtenir. I no afecta al funcinoament d’altres coses.
Tipus de promotors induibles:
“heat-shock” promoter : endògen, promotor que ja tenim a l’organisme on volem expressar el gen, incubant l’organisme a 37 graus ja indueixes l’expressió del gen.
Promotors que s’indueixen per hormones : si apliques la hormona s’indueix la proteina.
Promotors de la metalotioneina del ratolí. Metalotioneina son proteïnes que s’uneixen als metalls, com cd i zn, i tenen un paper molt important en la destoxificacio de contaminants. Què hauriem de fer? Posar el gen sota control d’aquest promotor i si afegim CD o Zn induiriem l’expressió.
En els tres casos, quan afegim el factor que indueix (ZN, hormones etc), ‘inconvenient és que qualsevol dels factors ens induirà TOTS els promotors que també s’indueixin per tots aquests. Tindrà afectes colaterals.
part del receptor glucocorticoides i a més. Quan hi hagi ecdisona es desencadenarà la transcripció. La part dreta te parts de 3 proteïnes diferents F 0 E 0proteïna de fusió.
Hi ha molt poc zona codificant, per tant la probabilitat de que quan posem un transgen al genoma entri en una zona codificant i trenqui la pauta de lectura és baixa.
Quines possibilitats tenim a l’hora de fer inserció dirigida de gens?
Per parlar d’inserció dirigida ens ha de parlar de 2 coses: rec. específica i homòloga
HOMÒLOGA: Es dóna a tots els organismes i usa recombnases endogenes. Es pot donar arreu del genoma. En mamífers es dóna amb moltíssima eficiència en les cèl·ules gerimnals però en les altres cèls en un perectatge molt baix.
ESPECÍFICA DE LLOC: Tenim seqüències específiques. Calen recombinases/enzims específics. Es dona a curtes regions de reconeixement.
DIFERÈNICES: Específica és una seqüència curta el que s’insereix. És específica. A cada lloc de recombinació hi ha una recombinasa. Homòloga és una seqüència llarga i és una qualsevol, inespecífica. Recombinasa és endògena.
La recombinació homòloga és un procés poc freqüent en altres cèl·lules que no siguin les sotmeses a meiosi. No obstant el llevat Saccharomyces cerevisae és l’excepció i això ha permès que els 6000 gens del genoma de llevat hagin estat sistemàticament “knocked out” mitjançant recombinació homòloga.
Aquestes recombinases actúen tallant els llocs específics de tall i ajuntant els extrems tallats. Les recombinases específiques de lloc permeten fer alteracions dirigides en el genoma:
- Insertar gens a una localització concreta / Reorganitzar cromosomes
- Substituir un o varis exons / Eliminar marcadors de selecció
Les cèl·lules que contenen la correcta reorganització poden ser seleccionades perquè els dos vectors diana estan dissenyats de forma que la recombinació entre llocs lox produeix un marcador de selecció funcional.
A l’extrem 3’ es posa el mateix que al principi però amb l’extrem 3’ d’hprt. Els dos loxP poden, mitjançanat la cre recombinasa. La cre recombinasa ens recombina els dos loxP. Ens talla els dos loxP i ens lliga la seqüència. Els residus no afecten en la codificació de la proteïna. Aquest procés és directament en les cèl·lules vives F 0 E 0in vivo.
En aquest cas, el tros que hem eliminat. `què passarà amb aquest tros dins de la cèl·lula? Quan estem en cèl·lules eucariotes tot allò que es duplica es divideix necessita un centròmer, per tant estarà a les primeres cèl·lules però llavors s’eliminarà. Hem aconseguit eliminar aquest gran fragment. Hi ha tres punts cabdals: 1a, 2a i 3a selecció.
Quan es dóna la recombinació entre els loxP el fragment de dins desapareix i els 2 trossos queden propers físicament. Van aconseguir una proteïna funcional.
Ho van fer en cèl·lules embrionàries de ratolí i van produir descendència. Van veure que el que tenia la mutació en els dos cromosomes no eren viables, però els heterozigots, una quarta part si que presentava el síndrome. I van relacionar la delecció amb la malaltia.
Zinc-Finger nucleases
Imatge relacionadaLa inserció orientada de gens (gene targeting) és el procés que consisteix en substituir el gen endogen per un fragment de DNA donador extra cromosòmic a través de recombinació homòloga. La recombinació homòloga és una forma de reparació molt acurada que és bàsica per la supervivència de la cèl·lula. El “gene targeting” espontani no és un procés eficient en plantes i animals. En canvi la introducció de trencament de doble cadena en el cromosoma (DSB, double-strand break) a un lloc únic del genoma estimula la recombinació homòloga a aquesta zona. Les Zn-finger nucleases han estat dissenyades per tallar seqüències de DNA especifiques. Indueixen recombinació homòloga local al lloc de tall.
L’avantatge de la rec hom és que permet editar el genoma en cèl·lules vives. Una possibilitat seria amb la zinc finger nucleases. Aquestes són dits de zinc, són unes proteïnes que tenen capacitat per reconèixer el DNA.
La ZF si la fusiones a una nucleasa, et reconeix el DNA i a més el talla. Si ho fusiones a un activador fas que s’uneixi i que a més activi la transcripció, i pots obtenir diferents funcions. Té una zona de reconeixement del DNA.
Se sap que en determinades posicions pot reconeixer uns determinats nucleòtids. Cada ZF reconeix 3 nts F 0 E 0quants més ZF posis, més especificitat hi haurà. Perquè amb 1 ZF sol només es podria unir a mil llocs d’un gen.
Quan fem el tall a dalt i a baix poden passar dues coses:
1 Que es tornin a unir els dos fragments 2 Que hi hagi reparació per homologia. Si a part del doble tall, donem un DNA homòleg a les dues zoes amb un gen inserit ens permetrà inserir un gen.
Quin avantatge té respecte les ZF? Les ZF són semblants en el sentit de que fem servir el doble tall en les cadenes de DNA per estimular la rec homòloga. Els dos permeten inserció dirigida de gens. Quin dels dos sistemes creieu que és més poderós? Perquè les ZF provoqui el doble tall s’havia de tenir molt clar quins aa s’aparellaven F 0 E 0això vol dir que en funció de la seq tindrem seqüència diferent de ZF: això no és fàcil de dissenyar i és caríssim (aprox 5. euros). El CRISPR costa moltissim menys, de l’ordre de 30 euros.
TOPO TA vectors
Subclonatge d’un gen entre vectors a través d’enzims de restricció és complicat i llarg de temps quan s’utilitzen diferents vectors que tenen diferent llocs de restricció.
topoisomeraseHi ha mètodes de TA cloning que eviten l’ús de les DNA lligases. Vectors topo TA tenen la característica de tenir toposiomerases unides als seus extrems. A més s’aprofiten del mecanisme de la PCR. Una taq de batalla quan s’acaba afegeix Adenosines als extrems això té l’avantatge: si tenim vectors que té una T penjant als extrems, farà que, aquest extrem protuberant pot ser lligat en un vector que té T protuberant F 0 E 0TA cloting, es puguin unir amb les A. Llavors en aquest sistema tenen Topoisomerases (que poden tallar i lligar) i si tenim un vector amb Adenosines s’hi podran unir.
Una vegada la topoisomerasa ha fet la lligació, es desenganxa del vector. Avantatge: ens permet d’una manera molt ràpida, a partir d’un producte de PCR, una clonació de DNA. Amb 5’ es podria fer (molt poc temps).
Les Topoisomerases s’utlitzen en la clonació TA tallant el vector i unint les topoisomerases als extrems. Quan el producte de PCR és afegit la Topoisomerasa uneix covalentment el producte de PCR al vector.
Sistema Gateway : Ens permet estalviar molts passos de la clonació típica de gens. Si
pensem en clonació amb lligases i enzims de restricció.
2782Amb el sistema gateway ens estalviem etapes. Aprofita les recombinases del fag landa. Necessita la recombinasa del fag landa i llocs de recombinació específica de lloc (ATTL en aquest cas). ccdB (gen letal, codifica per proteïnes tòxiques) és letal per a les cèl·lules que el tenen. Quan afegim recombinasa LR clonase, es dóna com un canvi de gens. Les cèl·lules que no hagin incorporat el gen d’interès no podran créixer perquè tindran el gen letal. La
recombinada LR ens talla i ens lliga. Ens estalvia les passes de purificació. És un sistema molt ràpid. Com incorporem el gen d’interès al vector d’entrada. Es podria fer amb la tècnica tradicional d’enzims de restricció però tornaríem a tardar bastant temps. es podria fer amb un sistema de topoisomerases.
Quina avantatge té el sistema gateway, a part de que ens estalvia passos? Només et cal tenir suficient LR clonasa per fer el pas, automàticament pots anar a diferents vectors.
Knockout: ens permet mutar gens
Knock in: ens permet revertir la mutació.
Knockdown: baixar l’expressió del gen/silenciar.
c)Quina seq. posem a la z. gateway? El promotor, ens controlarà diferents gens reporters (GFP/GUS...)
d) Zona codificant de la prot. Vigilar que no es corri l’ordre de lectura.
Sistema TAP (Tandem affinity purification): La tècnica del TAP permet
purificar les proteïnes que interaccionen amb la nostra proteïna d’interès. TAP: purificació d’afinitat en tàndem.
Serveix per purificar tot el que interaccionen amb la nostra proteïna in vivo (dins la cèl·lula viva). Mateixa finalitat que el doble híbrid. Quina avantatge té sobre el doble híbrid? Ens permet solucionar els problemes que té el doble híbrid: falsos positius o negatius i que no totes les proteïnes es poden analitzar amb doble híbrid (la interacció s’ha de donar en un orgànul concret al citoplasma i llavors ha d’anar al nucli i no val per proteïnes localitzades a altres llocs).
A més té una altra avantatge, ens dóna info estequiomètrica de la interacció. Pots veure si la teva proteïna X t’interacciona amb 2 protA, 3 protB etc. Quantes molècules tindràs de les altres proteïnes les quals s’uneix.
A la foto: és un cassette. Hi ha molts components que podem identificar:
TRP1: gen que codifica pel gen triptòfan.
Gal 1 : ens controla la síntesi del missatger de trp1.
ProtA: prot strafilococcus que té la capacitat dunir-se a immunoglobulina G (servirà per purificar en una cromatografia).
TEV : diana per endoproteasa: usant la prot TEV podrem tallar a la zona on està.
