microbiologia I, Apuntes de Microbiología

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MANUAL DE PRÁCTICAS

DE MICROBIOLOGÍA I

FACULTAD DE FARMACIA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

Y PARASITOLOGÍA

GRADO DE FARMACIA

1 NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

A continuación se anexa el documento sobre las normas de seguridad disponible en la

página web de la Facultad de Farmacia siguiente:

http://www.usc.es/export/sites/default/gl/centros/farmacia/descargas/horarios1112/Nor

mas_de_seguridade_nos_laboratorios_de_practicas.pdf

3 NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

4 NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

6 NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

7 NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

9 NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

10 NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

12 NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

13 NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

NORMAS DE SEGURIDAD ESPECÍFICAS DEL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA

Es imprescindible el uso de bata de laboratorio

Cada estudiante tiene un lugar de trabajo en el laboratorio. Como tal ha de mantenerse limpio y

ordenado siguiendo el principio "cada cosa en su sitio y un sitio para cada cosa". Las ropas y

efectos personales han de guardarse fuera del laboratorio.

Todo trabajo microbiológico debe estar presidido por: orden, limpieza, y habilidad para

aumentar la eficacia del mismo. Al finalizar cada práctica el material que haya de ser desechado

ha de depositarse en bandejas o cestillos adecuados para ser llevado a esterilizar antes de ser

lavado

Ha de realizarse un cuaderno de prácticas donde se anotarán las explicaciones y el trabajo

realizado, pero libros, carpetas u otro material deben estar apartados del lugar de trabajo. Las

notas se realizarán al finalizar la práctica y con la mesa perfectamente recogida

Durante el tiempo de trabajo hay que evitar cualquier otra actividad (fumar, comer...) y no

olvidar que se están manipulando microorganismos patógenos o potencialmente patógenos.

No tocar en ningún caso los cultivos ni abrir el material estéril. Hay que adquirir conciencia de

que es siempre imprescindible trabajar en el entorno de la llama. No olvidar que se está

trabajando con material estéril y hay que evitar siempre las contaminaciones. En todo caso tener

mucha precaución con los mecheros asegurándose que todas las llaves de paso están cerradas al

finalizar la práctica y evitar la presencia de sustancias inflamables (alcohol) en las proximidades

de la llama

Debe evitarse los desplazamientos innecesarios por el laboratorio ya que pueden crear corrientes

que originen contaminaciones o producir accidentes. Por supuesto nunca se abriran las

ventanas

Cada estudiante es responsable del material de su lugar de trabajo y ha de quedar perfectamente

limpio y ordenado al acabar cada práctica (retirar el papel de filtro etc..) En caso de accidente

(derrame de algún cultivo bacteriano) avisar inmediatamente al profesor para tomar las medidas

adecuadas. En cada mesa habrá un frasco de cloruro mercurico al 1/1000 u otro desinfectante

como el alcohol

Nunca se debe tirar nada por el fregadero o a la basura común ni bajo ningun

concepto debe sacarse ninguna muestra del laboratorio

Antes de salir del laboratorio deben de lavarse las manos y desinfectarlas

Todo el trabajo realizado siguiendo las normas que se indican tienen como finalidad el formar

una "conciencia bacteriológica"que difiere de cualquier otro tipo de trabajo experimental y es lo

que da un caracter diferencial a esta disciplina. Este modo especial de actuar es lo que crea los

conceptos fundamentales de esterilidad y de contaminación.

14 ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL

TRABAJO EN CONDICIONES ESTÉRILES. ESTERILIZACIÓN

En Microbiología se define esterilización como la destrucción o eliminación total de todos los microorganismos vivos en un objeto o material, incluyendo las endosporas bacterianas. La esterilidad es un estado absoluto, no hay grados de esterilidad.

El material que se va a esterilizar debe prepararse de tal manera que se conserve sin contaminar una vez esterilizado:

• El material de vidrio , como tubos, matraces, frascos, etc, se cierran con algodón graso o tapones metálicos para evitar la entrada o salida de los microorganismos. Además, cuando se usa algodón, ha de cubrirse éste con un papel impermeabilizado. En el caso de las pipetas, se les coloca en la boquilla un trocito de algodón que actuará como filtro, evitando la contaminación del operario con los microorganismos de la muestra y que éste a su vez contamine la muestra. Una vez preparadas, se introducen en estuches o cajas metálicas, o bien se envuelven individualmente en papel satinado para ser posteriormente esterilizadas. Todo el material de vidrio se esteriliza con calor seco, generalmente en un horno Pasteur.
• El material de plástico desechable ya se suministra estéril y listo para su uso. Por ejemplo, las placas de Petri se introducen en bolsas de plástico selladas y se esterilizan con óxido de etileno o radiaciones.
• Las soluciones y medios de cultivo líquidos se envasan en matraces o tubos y se esterilizan, generalmente, en autoclave. Existen varios métodos para llevar a cabo el proceso de esterilización y la elección de uno determinado viene condicionada por el tipo de material que se quiere esterilizar.

El método más comúnmente empleado para destruir los microorganismos es el calor, entre otras razones porque es el más económico y el más fácil de controlar. El calor utilizado con este fin puede aplicarse en forma de calor seco o de calor húmedo. El calor seco destruye los microorganismos por efectos de oxidación y se requieren temperaturas muy elevadas. El calor húmedo elimina los microorganismos a temperaturas menores, ya que la presencia de agua acelera la rotura de los puentes de hidrógeno responsables de la estructura terciaria de las proteínas, haciendo que éstas se desnaturalicen y pierdan por tanto su funcionalidad.

• La esterilización por calor seco puede hacerse por flameado o mediante estufas de aire caliente: Flameado : Se emplea para esterilizar asas e hilos de siembra, pinzas, espátulas, etc. Consiste en someter directamente a la acción de la llama de un mechero Bunsen los utensilios que se vayan a esterilizar. Este método es rápido y su eficacia es altísima, sin embargo no se puede aplicar a objetos termolábiles. Esterilización por aire caliente : Se lleva a cabo en estufas de aire caliente y consiste en colocar los objetos que se van a esterilizar, debidamente protegidos para que no se contaminen una vez esterilizados, en el interior de una estufa. Este procedimiento se utiliza para esterilizar material de vidrio: Pipetas, matraces, tubos, etc. u otros materiales termorresistentes. Las temperaturas a las que se someten estos materiales son muy elevadas (160-180ºC durante cerca de 2 horas). Estas temperaturas no pueden utilizarse para esterilizar líquidos (como medios de cultivo), ya que al llegar a los 100ºC comenzarían a hervir y continuarían hirviendo sin elevar su temperatura por encima del punto de ebullición del agua a presión atmosférica y a esta temperatura las endosporas bacterianas pueden sobrevivir durante 7 horas. Pero incluso en muestras en las que supiésemos que no existen endosporas, esta metodología puede implicar cambios en la concentración de los componentes del medio, a causa de la fuerte evaporación sufrida.
• El calor húmedo también se utiliza para la destrucción de los microorganismos siendo, a igual temperatura, mucho más eficaz que el calor seco; con este tratamiento las enzimas se desnaturalizan rápidamente, al igual que las membranas celulares. Además, el vapor de agua, especialmente si se genera a sobrepresión, es un eficaz transmisor de calor al Interior de la célula microbiana. Se puede aplicar utilizando varios métodos: Ebullición, vapor fluente y vapor saturado a presión:

15 ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL

Ebullición : El agua hirviendo (100ºC) tiene acción limitada, ya que aplicada durante 10 minutos va a destruir las formas vegetativas de los microorganismos, pero las endosporas bacterianas pueden sobrevivir incluso a tratamientos prolongados. Se podría utilizar el baño María o baño de agua hirviente (sólo con fines de desinfección en el laboratorio), cuando no se necesita alcanzar la esterilidad o cuando no se dispone de otros métodos mejores, tanto para material (pinzas, tijeras, escalpelos, etc) como para medios de cultivo que no puedan esterilizarse en autoclave. Vapor fluente : Esta técnica se emplea con frecuencia para esterilizar medios de cultivo que no se puedan someter a una temperatura superior a 100ºC sin que pierdan alguna de sus propiedades, como leche, azúcares, suero, etc. Se utiliza un autoclave a presión atmosférica, con la espita abierta, donde nunca se superan los 100ºC, y se realiza el proceso durante tres días consecutivos, dejándose a temperatura ambiente en los intervalos entre dos tratamientos. La muestra se somete a calentamiento (100ºC) durante 30-45 minutos destruyéndose en este proceso las formas vegetativas pero no las endosporas termorresistentes. Si éstas se encuentran presentes en la muestra germinan después del calentamiento y estas formas vegetativas serán destruidas en los siguientes ciclos. Este método de esterilización se denomina también esterilización fraccionada o tindalización. Vapor saturado a presión : La esterilización por esta técnica utiliza vapor de agua saturado que se somete a una atmósfera extra de presión sobre la presión atmosférica normal, elevándose con ello el punto de ebullición del agua de 100ºC a 121ºC y consiguiéndose la destrucción de todos los microorganismos (salvo los termófilos extremos) en un tiempo de 15 a 20 minutos. Esta temperatura es también necesaria para la destrucción de las endosporas bacterianas, que presentan una alta resistencia térmica y que pueden sobrevivir, como ya se ha indicado, a 100ºC durante horas. El vapor de agua difunde por ósmosis a través de las membranas de las esporas, coagulando su protoplasma, fenómeno que se acentúa si el vapor es saturado y a sobrepresión. Esta técnica de esterilización requiere el uso del autoclave.

El AUTOCLAVE permite elevar la presión una o dos atmósferas sobre la presión atmosférica, elevándose con ello la temperatura de ebullición del agua que se encuentra en su interior. Consta de un recipiente metálico, generalmente de acero inoxidable, similar a una gran olla, en cuyo interior se introduce el material a esterilizar que se coloca sobre una rejilla o placa agujereada. Después de cerrar cuidadosamente la tapa, se conecta la fuente de calor y comienza a elevarse la temperatura en su interior. La salida continua del chorro de vapor a través de la válvula nos indica que el aire contenido en el interior del autoclave ha sido eliminado. La eliminación de este aire es importante ya que la difusión del calor entre el vapor de agua y el aire es pobre, por lo que no se alcanzará la temperatura esperada a la presión elegida y no se conseguirá la esterilización. La válvula se cierra cuando sólo sale vapor de agua y, a partir de ese momento, comienza a elevarse la presión hasta una atmósfera sobre la presión normal, elevándose como consecuencia la temperatura hasta 121ºC. Transcurridos 15- minutos, en estas condiciones, el material se ha esterilizado. Es el incremento de temperatura por encima de los 100ºC y no la presión la que destruye los microorganismos. Si se esterilizan volúmenes grandes de líquidos, es necesario mantener el material en el autoclave durante períodos de tiempo más prolongados, pues se tarda más en alcanzar los 121ºC en el centro de un gran volumen. Una vez transcurrido el tiempo necesario, se apaga el autoclave y se deja descender la temperatura hasta que el indicador marque menos de 80ºC, que será cuando la presión haya descendido hasta presión atmosférica. Se abre ligeramente la espita para comprobar que no queda vapor a presión en el interior y ya se puede proceder a retirar todo el material esterilizado, dejándolo enfriar a temperatura ambiente. El autoclave se utiliza para esterilizar medios de cultivo, instrumentos, ropas, soluciones, jeringas, etc que puedan soportar altas temperaturas y una atmósfera de sobrepresión.