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PRÁCTICAS
MICROBIOLOGÍA I
Nuria González Pouso
PRÁCTICA 1: Preparación de medios (placas de Levine y TSA)
Para realizar esta práctica necesitamos caldo de TSB al que hay que añadirle 18g/l de agar, nosotros prepararemos medio litro. Hacemos lo cálculos y necesitamos 9 g de agar, 15 g de caldo y medio litro de agua destilada. Mezclamos todo en un bote de vidrio: TSB +agar +agua destilada= TSA. Una vez mezclado le ponemos una tira adhesiva con una marca negra en la tapa cerrada que nos indica si en el autoclave se alcanzó la temperatura de 1200. Una vez pasados los 15 minutos esperamos a que baje la presión del autoclave y lo sacamos, ya esterilizado, y lo dejamos enfriar metiéndolo en agua fría directamente.
Lo sacamos del baño cuando ha alcanzado los 45 ºC, y antes de que solidifique el medio en el bote distribuimos la mezcla en las placas de petri, siempre bajo la llama, manteniendo esterilizada la zona de trabajo.
Abriendo una a una echamos el medio de cultivo en las placas y las dejamos enfriar, esto se ha de hacer rápidamente para que el medio no solidifique en el bote.
** ¿ Cómo asegurarse de lo que está dentro de la botella ha alcanzado la tª necesaria? Comprobando la tira marrón que se utiliza para saber si dentro del autoclave se llego a la temperatura de 120 º, esto sabemos que ocurre porque la tira marrón se despega del tapón de la botella.
PRÁCTICA 2: Observación macroscópica.
Tenemos dos placas, una de TSA con aislamientos de distintos grupos bacterianos, y otra de contaminación ambiental.
La primera placa observada es la de contaminación ambiental. Forma: irregular (recuerda a un trébol), el centro del microorganismo es arrugado, con el color más claro en el centro y va oscureciendo a medida que se aleja de este. El cultivo lleva varios días proliferando, ya que el grosor del centro es notable, lo que quiere decir que el agua se está desecando. Tamaño: grande (>3mm) Color: ocre Borde: ondulado Elevación: umbonada Superficie: rugosa
La segunda placa se trata de una muestra de 3-Pseudomonas fluorescens (Placa de TSA): Forma: circular Tamaño: pequeño (1-2mm) Color: ocre Borde: entero Elevación: convexa Superficie: brillante
PRÁCTICA 4: Técnicas de aislamiento y siembra.
Aislamiento y siembra en placa TSA y EMB de Levine (a partir de cultivos mixtos)
Sembramos en dos placas petri el mismo cultivo, una placa con TSA (o medio genera, donde proliferan la mayoría de las bacterias), la otra placa con EMB LEVINE (o medio selectivo) A partir de un tubo de ensayo que contiene un cultivo mixto, cogemos una colonia con el asa de siembra curva (previamente esterilizada y enfriada) y la sembramos en la placa petri para ello, deslizamos suavemente en zigzag el asa sobre el medio, y vez vamos repartiendo de forma que alejemos las colonias de microorganismos lo máximo posible. Esto se hace para aislar las colonias y así poder hacer después hacer un mejor recuento de estas, además de poder obtener un cultivo puro. Una vez sembrado ponemos la placa petri boca abajo en la estufa a incubar a 37ºC 24 h. Pasadas las 24 h observamos el recuento de colonias a nivel macroscópico en los dos tipos de medios. Podemos observar que en el medio TSA hubo mayor crecimiento que en el medio EMB Levine, donde sólo crecieron poblaciones Gram (-). Siembra en líquido (TSB), en semisólido y en sólido (TSA) Siembra en medio líquido Con la ayuda de un asa de siembra curva (previamente esterilizada) cogemos una muestra de una cepa bacteriana aislada de la placa de TSA del día anterior y la inoculamos en un tubo de ensayo en medio líquido agitándola para asegurarnos que el cultivo se queda en el medio. A las 24 h observamos que el tubo presenta turbidez y algunos puntos negros, lo que indica que la composición del medio del tubo es apta para la proliferación. En el fondo también hay depósito de color blanquecino Siembra en sólido Se sigue el mismo procedimiento hasta el momento de la siembra, que la haremos con el asa de siembra curva siguiendo un patrón en zig-zag (siembra en slam, en condiciones de aerobiosis). La línea de zig-zag se vuelve de color amarillo oscuro. Siembra en medio semisólido. Para esto vamos a utilizar el asa recta, previamente esterilizada. Posteriormente hacemos la siembra en el tubo, introduciendo el asa casi hasta el fondo del tubo lo que se denomina siembra en picadura (siembra en medio anaerobio) En este caso no observé turbidez, solo unas cuantas burbujas lo que indica que le organismo es productor de gas, pero no móvil.
PRÁCTICA 5: Curva de crecimiento
Para esta práctica medimos el crecimiento de una población bacteriana, utilizando como medida la turbidez del cultivo. En un tubo de TSB inoculamos 100 micro litros de Escherichia Coli, lo mezclamos y agitamos.
A continuación (600 nm) para medir la absorvancia, usamos como blanco un tubo de TSB sin inocular. A continuación agitamos el tubo con la Escherichia en un matraz agitador a 200 rpm. La D.O. inicial es de 0.0nm +30 min. D.O.: 0.0 nm +30 min D.O.: 0.03 nm +45 min D.O.: 0.14 nm Al final obtendríamos una curva de absorvancia frente al tiempo. Nosotros por falta de tiempo no pudimos completar el gráfico.
Práctica 6: Análisis microbiológico del agua
En esta práctica vamos analizar una muestra de agua para observar la presencia de los microorganismos en esta: enterococos, clostridium perfringens, cualiformes totales, bacterias heterótrofas por extensión y escherichia coli. Tenemos dos tubos, uno con una solución salina (9 mL) y otro con agua directa (agua del grifo). Pipeteamos 1 mL de directa en el tubo de ensayo de solución salina para así diluir la muestra, A continuación pipeteamos 0.1 mL de cada uno de os dos tubos y los cultivamos en un medio de TSA. A continuación extendemos la muestra con la ayuda de un asa de Drigalsky hasta que el medio la haya absorbido, y lo dejamos incubar 72 h. Después observamos el crecimiento: Tubo D Tubo - 24h 41 1 48h +50 + 72h +48 + total 139 7
Para el caso de las coliformes totales, enterococos y clostridium perfringens, filtramos 100ml de agua y depositamos el filtro con los microorganismos que
Pruebas metabólicas
Prueba de la catalasa: Esta prueba se utiliza para comprobar si hay enzima catalasa. Procedimiento: en un porta ponemos una gota de peróxido de hidrogeno y hacemos un frotis con ayuda del asa de siembra curva; si se forman burbujas indica que la prueba es catalasa positivo. En mi caso así fue.
Determinación del gran con KOH: Esta se utiliza para diferenciar las bacterias Gram (+) de las Gram (-); si son Gram (–) se formará un hilo y si son positivas no se formará. Colocamos una gota de KOH en el porta, con el asa de siembra curva cogemos cultivo de la muestra de TSA y hacemos un frotis sobre la gota, al levantar el asa no se forma el hilo, por lo tanto es el Gram (+).
Prueba de oxidación-fermentación de azúcares: Determina la capacidad de la bacteria para utilizar un azúcar en condiciones de oxidación o fermentación. Procedimiento: inoculamos dos tubos de medio Hugh-Leifson-glucosa, de un color verde y semisólido, por picadura. A uno de ellos se le echan unas gotas de parafina para crear un medio anaerobio. Se dejas incubar y al día siguiente observamos que en los dos casos hubo crecimiento de microorganismos, ya que los tubos pasaron de color verde a amarillo.
Prueba de reducción de nitratos: Verifica si el microorganismo es capaz de reducir nitratos a nitritos o a nitrógeno libre, utilizándolo como fuente de energía. Procedimiento: Para determinar la presencia de nitrito en el medio añadimos α- naftilamina y ácido sulfanílico, al añadirle unas gotas de ambos reactivos se observa el cambio a color rojo en el medio, lo que nos indica la presencia de nitritos, prueba positiva.
Pregunta de clase: ¿Porque se deja la tapa de la placa petri para bajo? Porque de este modo, el agar queda en la parte superior y al condensarse el vapor de agua que generan los microorganismos por su metabolismo, cae sobre la tapa, evitando que los microorganismos se diluyan, manteniéndose fijo al sustrato.
