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Las técnicas de microscopía son el conjunto de procedimientos de investigación que utilizan un microscopio para obtener imágenes de determinadas estructuras, las cuales, por ser demasiado pequeñas, resultan inapreciables a simple vista para el ojo humano.
Tipo: Apuntes
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FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL PRACTICA 2: MICROSCOPIA GRUPO 1 INTEGRANTES: PROFESOR: Pablo Araujo AYUDANTE: Francisco Gonzalez PERIODO: 2019-
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL RESUMEN. Identificación de los componentes del Microscopio y su funcionamiento. En primer lugar se llevó a cabo una inspección del microscopio, tanto del sistema óptico como del sistema mecánico, además se limpió el sistema óptico, y se reconocio cada una de sus partes, posteriormente se prepararon varias placas con muestras de distintos materiales, para ser observadas a través de diferentes lentes iniciando con el de menor aumento hasta el de mayor aumento, con lo que se logró obtener imágenes ampliadas de su estructura, según el aumento empleado, comparando la calidad de resolución de la imagen de los mismos y adquiriendo experiencia y conocimientos básicos de la función y manejo adecuado del microscopio. En conclusión, para una observación de calidad es necesario conocer el manejo correcto del microscopio y utilizar un objetivo adecuado según el material a observar, puesto que del objetivo depende la precisión de la imagen óptica y el poder de resolución. PALABRAS CLAVES: MICROSCOPIO/SISTEMA_OPTICO/ PODER_DE_RESOLUCION/ PODER_DE_AUMENTO
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL dos polarizadores. Esto significa que la onda de luz utilizada para observar la muestra tiene una dirección de oscilación concreta. Este tipo de microscopio es muy útil para observar estructuras cristalinas de rocas y minerales.” (Negroni,2009) Microscopio de fluorescencia “Los microscopios de fluorescencia son aquellos que utilizan las propiedades de fluorescencia para generar una imagen de la muestra. Este microscopio permite observar sustancias que emiten luz propia cuando son iluminadas con una longitud de onda determinada.” (Negroni,2009) 2.1.2 Microscopios según el número de lentes Microscopio simple “Este tipo de microscopio dispone de una única lente y es más habitualmente conocido como lupa. Aún así, con un microscopio simple pueden conseguirse grandes aumentos. Hay que destacar que durante el siglo XVII, Antonie van Leeuwenhoek utilizó este tipo de microscopios para conseguir el mayor aumento alcanzado hasta el momento.” (Montoya,2008) Microscopio compuesto “Este tipo de microscopio es aquél que dispone de por lo menos dos lentes. Este es el caso más habitual en todos los microscopios modernos. Normalmente los microscopios disponen de distintas lentes tanto en el objetivo como en el ocular para corregir las aberraciones ópticas y alcanzar una imagen con buena calidad.” (Montoya,2008) 2.2.3 Microscopios según la transmisión de la luz Microscopio de luz transmitida “En este tipo de microscopio la luz atraviesa la muestra. Para esta clase de microscopios es necesario preparar la muestra cortándola en láminas muy finas. La muestra se ilumina desde debajo la platina. La preparación de la muestra hace que esta sea semitransparente y parte de la luz pueda atravesarla y llegar al objetivo para ser observada posteriormente a través del ocular.” (Montoya,2008) Microscopio de luz reflejada
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL “En este caso la luz ilumina la muestra y parte de esta es reflejada y dirigida al objetivo. De este modo es necesario iluminar la muestra desde la parte superior de la platina. Este tipo de microscopía es utilizada para examinar materiales opacos como pueden ser estructuras metálicas, materiales cerámicos, etc.”(Montoya,2008) 2.1.3 Microscopios según el número de oculares Microscopio monocular “Este tipo de microscopio dispone de un solo ocular a través del cual se puede observar la muestra. Es el tipo más sencillo y es ideal para aficionados a la microscopía o para alguien que se introduce en este campo. Su desventaja principal es que puede resultar un poco incómodo si tiene que utilizarse durante largos periodos de tiempo.”( Carter,2010) Microscopio binocular “Los microscopios binoculares disponen, como indica su nombre, de dos oculares. Esto permite observar la muestra simultáneamente con los dos ojos resultando en una mayor comodidad para el usuario”. (Carter,2010) Microscopio trinocular “El microscopio trinocular está equipado con dos oculares para observar la muestra además de un tercer ocular para conectar una cámara. En el caso de conectar una cámara digital esta puede conectarse a un ordenador para ver la imágenes de la muestra en tiempo real. ” (Carter,2010) 2.2. Microscopio óptico “El microscopio óptico, utilizado con mayor frecuencia para la mayoría de los estudios, utiliza el sistema de iluminación que se conoce con el nombre de campo claro, en el cual el campo del microscopio se ilumina brillantemente, mientras que el objeto que se va a estudiar se ve oscuro o coloreado. La mayoría de los microscopios alcanzan los 1000 y algunos los 2000 aumentos, con oculares de 10 diámetros y objetivos de 100 diámetros de aumento, haciendo posible que las partículas de 0,2 micrómetros puedan ser amplificadas a 0,2 milímetros, así resultan claramente visible.” (Montoya, 2008) 2.2.1. Sistema óptico.
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL 2.4.2 Preparaciones Fijas “ Las preparaciones fijas o permanentes son aquellas que se han sometido a un proceso largo de preparación, el que permite que se mantengan en buenas condiciones para su observación por periodos prolongados de tiempo. La preparación de estas muestras incluye etapas de fijación del material, deshidratación, inclusión en parafina, en un portaobjetos.” (Tortora, 2017)
3. PARTE EXPERIMENTAL 3.1. Material y Equipo. 3.1.1. Microscopio óptico. 3.1.2. Preparaciones fijas. 3.1.3. Portaobjetos y cubreobjetos. 3.1.4. Pipeta. 3.1.5. Lanceta 3.1.6. Toallas de papel absorbente 3.1.7. Picetas 3.1.8. Palillo de dientes 3.1.9. Papel milimetrado 3.1.10. Hoja de matacallo 3.2. Sustancias y reactivos 3.2.1. Aceite de inmersión. 3.2.2. Sangre 3.2.3. Azul de metileno 3.2.4. Agua estancada 3.2.5. Preparaciones fijas 3.2.6. Alcohol C 2 H 6 O(l) 3.2.7. Agua. H 2 O(l) 3.3. Procedimiento 3.3.1. Observación de papel milimetrado 3.3.1.1. Coloque una gota de agua en el portaobjetos. 3.3.1.2. Coloque un trozo de papel milimetrado y cubra la preparación.
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL 3.3.1.3. Situé la placa sobre la platina sujetándola con las pinzas. 3.3.1.4. Precise la observación ajustando tanto el ajustador macrométrico y micrométrico 3.3.1.5. Observe con los lentes de 4x y 10x. Realice el cálculo del poder de resolución con el lente de mayor aumento. 3.3.1.6. Grafique la observación. 3.3.2. Observación placa fija: 3.3.2.1. Enfocar las preparaciones fijas con los lentes 10x y 40x y observar. 3.3.2.2. Graficar lo observado. 3.3.3. Preparaciones frescas. Células de la mejilla 3.3.3.1. Colocar una gota de agua en el portaobjetos. 3.3.3.2. Coger un palillo de dientes y raspar la parte interna de la mejilla para recoger células. 3.3.3.3. A continuación, mezclar el palillo con el agua del portaobjetos durante unos segundos para depositar las células. 3.3.3.4. Colocar el cubreobjetos sobre la gota de agua del portaobjetos intentado evitar la formación de burbujas. 3.3.3.5. Depositar una gota de azul de metileno sobre uno de los bordes del cubreobjetos y espera unos minutos hasta que el tinte haya empapado parte de la muestra. 3.3.3.6. Utilizar papel secante para eliminar el exceso de tinte y agua en las partes laterales del cubreobjetos. 3.3.3.7. Coloca el portaobjetos en la platina y empieza con su observación utilizando el objetivo de mínimo aumento. Sangre****. 3.3.3.8. Desinfectar la zona, con mucho cuidado pinche una yema del dedo y con ayuda de la pipeta tome una muestra de sangre. 3.3.3.9. Coloque inmediatamente en el portaobjetos y coloque el cubreobjetos sin formar burbujas.
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL 10x 1344 40x 516. Tabla 3. Observaciones. Muestra Observación Papel Milimetrado 4x Se identifican las líneas de color azul un poco más grandes y gruesas. 10x Se observa el papel y sus líneas un poco distorsionado debido a que la tinta azul de las líneas ya no se ve uniforme y más se ve el papel con pequeñas estructuras geométricas. 40x Se puede observar pequeñas líneas y círculos enredados y la tinta azul del papel milimetrado ya no está uniforme, sino que también está siendo atravesado por líneas y círculos. Células de la mejilla 4x No se puede identificar nada más que una coloración celeste que puede ser por el colorante que se utilizó. 10x Se identifican pequeñas formas con un tono más intenso de color azul.
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL 40x Se observó unas pequeñas manchas de color intenso azul y unas burbujas pequeñas sin color. Agua estancada 4x No se logró observar ningún microorganismo. 10x Solo se observan pequeños puntos de color café. 40x Las estructuras de los microorganismos no fueron evidenciadas con ningún lente. Sangre 4x No se logra identificar formas geométricas más bien se ve como unas manchas color rosáceo. 10x Se empieza a observas unos pequeños círculos y óvalos (glóbulos rojos) aglomerados de colores variados entre rojos intensos y suaves. 40x Ya se identifica los glóbulos con más claridad y además se notan distintas formas y pequeñas
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL de burbujas entre la porta y cubre objetos, lo cual imposibilitó una breve identificación de los componentes sanguíneos (glóbulos rojos) presentes en la muestra. Se recomienda al momento de colocar el portaobjetos en la platina cerciorarse de que la misma se encuentre en el límite de la parte inferior, con el fin de ir elevando la muestra (preparación) mediante los tornillos macro y micrométrico (anterior a ello colocar el lente objetivo de menor aumento), esto permitirá un mejor campo visual del objeto a observar y posteriormente facilitará el enfoque de este. También es importante ser muy riguroso al momento de colocar encima de la preparación el cubreobjetos ya que de no hacerlo de forma diagonal a la portaobjetos existe una gran probabilidad de formar burbujas dentro de la preparación, lo cual evitará visualizar e identificar de forma correcta los organismos presentes en la misma.
8. CONCLUSIONES 8.1. Mediante la práctica se conoció el microscopio, sus partes y la función que cumplen cada una de ellas respectivamente. También, se verificó la inversión de la imagen ya que se observó la letra “e” al revés, además el poder de resolución depende de la longitud de onda, siendo estos directamente proporcionales, sin embargo, en la práctica esta magnitud es constante por lo que en el poder de resolución influyo únicamente la apertura numérica del lente objetivo. (Cristhian Muñoz) 8.2. Según la tabla 2 se puede concluir que dependiendo del lente empleado se obtiene mejor resolución, así como mayor nitidez en la imagen y se observó con más detalle ciertas particularidades de las muestras tratadas, así como en la muestra de sangre se logró identificar los glóbulos rojos. (Jessica Capa ) 8.3. De los anexos generados mediante la experimentación, se tomó como ejemplo de análisis a la preparación con contenido de hemoglobina (célula eucariota) para su posterior conclusión. Se puede observar que cada uno de los anexos fue evaluado a partir de distintos lentes objetivos los cuales se encuentran en función de la apertura numérica preestablecida siendo dichos valores iguales a [0,1; 0,25 y 0,65] para los lentes objetivos de [4X, 10X y 40X] respectivamente, observando que a medida que la apertura numérica aumentaba al momento de observar la preparación de células sanguíneas, la imagen capturada contenía mejor calidad y nitidez
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL (resolución), concluyendo en base a la observación realizada que la apertura numérica es una propiedad importante que define un parámetro óptico como la resolución, esto quiere decir que la apertura numérica es directamente proporcional al poder de resolución y este no depende de la magnificación del lente objetivo; ya que una gran magnificación o aumento de una imagen no garantiza una buena resolución de la misma, en cambio en el caso de la apertura numérica esto es garantizado. (Gabriel Ponce) 8.4. Se identificó las funciones que realizan las diferentes partes del microscopio mediante las experimentaciones realizadas a través de sistemas mecánicos de este equipo óptico, por ejemplo el movimiento de la imagen de un microscopio óptico se encuentra cabeza abajo y si se mueve la preparación hacia un lado se observa que se desplaza en sentido opuesto, estas características se encuentran presentes en un microscopio de este tipo, además podemos regular el aumento de los lentes, lo que nos permite tener un enfoque de manera más preciso al espécimen sin embargo, este tiene una consecuencia, el cual es el poder de la resolución de la imagen, es decir mientras más cerca observamos al espécimen, la calidad de la imagen se reduce lo cual son inversamente proporcional. Por ultimo adquirimos información sobre la apertura numérica del microscopio y que esta depende de un ángulo de aceptación máxima que puede entrar o salir del lente, el medio en el que se encuentra la muestra y por el índice de refracción, se puede decir también que a menor apertura numérica menor poder de resolución. (Lizeth Pullutasig) 8.5. Se concluye que la manera correcta de enfocar un objeto es utilizando los tornillos macro y micrométricos ya que estos permiten una visualización de menor a mayor aumento, a medida que se sube el rango de los lentes esto se observa con más profundidad la estructura que se componen cada objeto analizado. Cada microscopio se compone de diferentes partes que son fundamentales para la observación de cada objeto, como sus tipos los cuales permite un acercamiento cada vez más exacto, claro permitiendo la visualización de una imagen virtual. (David Aymar)
9. APLICACIONES Este instrumento ha sido de gran utilidad, sobre todo en los campos de la ciencia donde la estructura y la organización microscópica es importante, incorporándose
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL tornillo hacia la izquierda la imagen se desplazó en sentido contrario, el mismo caso se presentó al mover el tornillo hacia la derecha, estas características se encuentren siempre presentes en un microscopio óptico. 10.4. ¿Por qué razón las muestras que se observan en el microscopio compuesto deben ser delgadas y utilizar un medio de montaje? La razón de que las muestras deben ser delgadas y utilizar un medio de montaje es para que puedan ser observadas a través del ocular ya que la luz del microscopio atraviesa los electrones, debido a esto la muestra mientras más delgada mejor, y al utilizar un medio de montaje es necesario para fijar las preparaciones, evitando que se desplacen y sea más fácil localizar la zona que queremos observar. 10.5. Explique las razones porque NO deben tocarse los lentes de un microscopio con los dedos. Investigue sobre las buenas prácticas en el uso de microscopio. Debido a que podrían quedar las huellas en las superficies de los lentes de un microscopio, y al moverlas se podría correr el riesgo de dañar su superficie, que es precisa y delicada a veces se puede dar la situación de que rayemos sin consentimiento la superficie de los lentes con nuestra piel la cual en las manos es generalmente más gruesa y tosca, estos rayones podrían ocasionar irregularidades en los rayos luminosos que la atravesarán, por otro lado podríamos recubrir la superficie de los lentes con grasa y de esa manera contaminar el instrumento que posteriormente podría afectar a otros usuarios. Algunas recomendaciones para el buen uso del microscopio son: Al momento de utilizarlo no se debe forzar los controles de foco, tener en cuenta que tipo de elemento se utiliza, no jugar con los elementos o utensilios del laboratorio. Al culminar con la experimentación, se deja el objetivo de menor aumento en posición de observación. Al finalizar colocar la funda para cubrir el microscopio y evitar que exista contaminación como polvo y deterioren los lentes. Evitar a toda costa tocar los lentes con las manos 10.6. Investigue sobre los diferentes tipos de microscopios y su utilización. 10.6.1. Microscopio digital Un microscopio digital tiene una cámara CCD adjunta y está conectada a un LCD, o a una pantalla de computadora. Un microscopio digital usualmente no tiene ocular para ver los objetos directamente. El tipo triocular de los microscopios digitales tienen la posibilidad de montar una cámara, que será un microscopio USB. (Randall, 2007) 10.6.2. Microscopio de luz reflejada Ilumina el preparado desde la parte superior a través del objetivo o lateralmente. La luz reflejada en el preparado es captada por el objetivo, es posible usar preparados
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL opacos o espesos. Se usan con frecuencia en la microscopia de fluorescencia o en la mineralogía. (Randall, 2007) 10.6.3. Microscopio estéreo También llamado "microscopio de disección", utilice dos objetivos y dos oculares que permiten ver un espécimen bajo ángulos por los ojos humanos formando una visión óptica de tercera dimensión. (Randall, 2007) 10.6.4. Microscopio de luz transmitida. Contemplan preparados transparentes y muy finos, más fino el preparado, más precisión de observación. Sin embargo, puede usar los microscopios de luz transmitida para ver la superficie de muestras de cuerpos opacos, como por ejemplo, granulados o sedimentos. En tales casos, el preparado se observa como un juego de luz y sombras. En este tipo de microscopios el rayo de luz suele proyectarse desde abajo, atravesando el preparado, cuando este sea transparente. En este tipo de microscopios la iluminación es de arriba hacia abajo. (Randall, 2007) 10.6.5. Microscopio de fluorescencia Es un tipo especial de microscopio liviano, que en vez de tener un reflejo liviano y una absorción utiliza fluorescencia y fosforescencia para ver las pruebas y sus propiedades. Se excita un colorante fluorescente en la muestra con luz a una determinada longitud de onda desde el exterior. El colorante fluorescente emita la luz, que se define como luz con la longitud de onda más larga que la luz excitada. En la trayectoria del rayo se puede separar mediante filtros ópticos la luz fluorescente de la luz excitada, reenviarla al ocular o la cámara. El límite de resolución está muy por debajo de un microscopio óptico convencional, lo que permite contemplar con precisión las estructuras de una célula o los procesos de células vivas. (Randall, 2007)
11. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 10.1. Gama Fuertes, M.A. Biologia 1: Un enfoque constructivista.3. ed. Mexico (Mexico). Pearson Educacion. 2007. 10.2. Randall, W. (2007). Portraits of life, one molecule at a time. Analitical chemistry. Editorial Analitical chemistry 11. ANEXOS 11.1. Diagrama del equipo. (Microscopios con sus partes). (ver Anexo 1) 11.2. Observaciones realizadas con el microscopio. (ver Anexo 2)
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL 12.1. Anexo 2. Figura 12.1.-1. Observaciones realizadas con el microscopio (papel milimetrado) Fuente: Universidad Central del Ecuador, Laboratorio de Biología- Guía de Laboratorio del Centro de Biología, Grupo 1. Figura 12.2.-2. Observaciones realizadas con el microscopio (Agua sucia) Fuente: Universidad Central del Ecuador, Laboratorio de Biología- Guía de Laboratorio del Centro de Biología, Grupo 1.
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL 12.1. Anexo 2. Figura 12.2.-1. Observaciones realizadas con el microscopio (hoja de matacallo) Fuente: Universidad Central del Ecuador, Laboratorio de Biología- Guía de Laboratorio del Centro de Biología, Grupo 1. Figura 12.2.-2. Observaciones realizadas con el microscopio (letra e) Fuente: Universidad Central del Ecuador, Laboratorio de Biología- Guía de Laboratorio del Centro de Biología, Grupo 1. Nombre Fecha UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE INGENIERIA QUÍMICA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL DIBUJO. (^) Grupo 1 2019/04/ REVISA. (^) Franciso Gónzale-Valerio 2019/04/ TEMA: MICROSCOPÍA Lam: 3
