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Resumen cat 1 uba para el primer tp
Tipo: Apuntes
2018/2019
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Aclaración: No reemplazan la bibliografía oficial, puede tener errores. Los hice según mis necesidades, esto quiere decir que hay cosas que pueden faltar puesto que ya las asimile o no me parecieron importantes.
MICROSCOPIA Y TECNICA Microscopio Óptico: LR 0,2 micrones Posee 2 lentes (Ocular y objetivo). Emplea Luz visible para iluminar el campo (absorción de luz) Parte mecánica: Pie Columna Platina (Soporte de la muestra) Carro (Recorrer el preparado) Tubo Revolver (Intercambiar objetivos) Tornillos macro y micro Parte Óptica: Objetivos Oculares Sistema de iluminación Condensador Diafragma Los lentes del microscopio óptico son convergentes y perpendiculares al plano de la palatina. Los microscopios tienen espejos de dos caras, una plana y otra cóncava. La cóncava se usa con la luz difusa y la plana con luz artificial. Objetivos : La imagen se ve real, invertida y aumentada en dos planos. 2 - 4x: Objetivo de campo 10x: Seco débil 40x: Seco fuerte 100x: inmersión Ocular: Imagen virtual aumentada y derecha del preparado. Límite de resolución: LR Es la menor distancia a la cual dos puntos pueden distinguirse como tales. Monoculares Binoculares
Microscopio electrónico de transferencia 0,2 a 0,5 nm (Nanómetros) (LR) permite el estudio de ultra estructuras celulares. La sección es atravesada por el haz de electrones. Microscopio electrónico de barrido Alto grado de resolución, imagen 3d y se ve en blanco y negro. Uso de bobinas electromagnéticas. Los electrones no atraviesan la muestra, sino que chocan con las células cubiertas con carbón o metales. Técnica Histológica en el microscopio electrónico Muestras de 1 o 2 mm, se fijan en glutaraldehido que se diluye y se posfija en tetroxido de osmio. Se deshidrata la muestra y se los pasa por un solvente, el óxido de propileno. Se incluyen en una resina tipo epoxi de gran dureza. Se corta con el ultramicrotomo (Cuchillas de vidrio o diamante). Las secciones se recogen en una grilla metálica y no en un portaobjetos de vidrio. Las secciones se colorean con metales pesados ejemplo el acetato de uranilo y el citrato de plomo. Técnica Histológica Técnica Los electrones son producidos por un filamento incandescente. La zona que fue atravesada por los electrones se verá electrolúcida y donde los electrones fueron retenidos por los metales se verá electro densa. Fijación Deshidratación y aclaración Inclusión Corte Desparafinar Coloración Montaje
Fijación Liquida. Volumen 10:1 respecto a la muestra. Evita la autolisis, detiene el metabolismo celular y preserva la estructura. Se hace por perfusión o inmersión. El fijador tiene que tener Ph neutro, con osmolaridad similar a la de la muestra para evitar el colapso de estructuras. Fijadores químicos : o Simples: Como el formaldehido 4% p/v y el glutaraldehido (ME) Para mantener el ph y la osmolaridad se diluyen en soluciones buffer. o Mezclas fijadoras: ejemplo el líquido de zenker. Fijadores físicos: Como la congelación por nitrógeno líquido. Las muestras se cortan utilizando un criostato. Evita alteraciones antigénicas, pero puede producir autolisis. Preserva la actividad de las enzimas. Deshidratación y aclaración Se elimina el agua para luego poder incluirlo (a la muestra) en medios no hidrosolubles. Se deshidrata sumergiéndolo en concentraciones crecientes de alcohol, esto evita la refracción. Se usa un aclarante para ser soluble con el medio de inclusión, el Xilol. Inclusión En parafina. La parafina se calienta para que pase a estado líquido, luego de que el tejido sea aclarado se sumerge en parafina (1:1) y se deja en la estufa de inclusión. Corte Se corta con el micrótomo y se sumerge en agua a 40° para ubicar en el portaobjetos (pre tratado con albumina) para que no se despegue. Desparafinar Se sumerge en xilol para remover la parafina y se hidrata con alcohol en graduación decreciente. Se hidrata para poder colorear (Colorantes hidrosolubles) Coloración Se tiñe con Hematoxilina primero y luego con eosina. El tejido se puede obtener de una biopsia o de una necropsia. Aprox 5mm la muestra Sustancias anfóteras Se comportan como sustancias acidas o básicas dependiendo del ph. Acidas en medio básico y básicas en medio acido.
Coloración de sudan: Sudan black B – Sudan III (Rojo). Se necesitan fijadores especiales como la congelación. Estos colorantes son solubles en lípidos (Reaccionan con el fosfato) Triglicéridos Colesterol Fosfolípidos Esteroides T. adiposo Tricromico de mallory : fucsina acida, azul de anilina y naranja g Fibras colágenas Fibras reticulares MEC del cartílago Hueso Citoplasma Núcleo Musculo Fibras elásticas Hematies Tricromico de van gieson : Acido pícrico, hematoxilina ferrica y fucsina Núcleos de color marrón o negro Fibras colágenas de rojo o rosado Citoplasma y musculo de color amarillo. Tricromico de masson: Hematoxilina de mayer, azul de anilina y fucsina panceu Núcleos: azul Citoplasma: Rojo Fibras colágenas: celeste Glóbulos rojos y musculo de fucsia Técnicas enzimáticas : Para localizar enzimas. Se requiere incubar el tejido con un sustrato para originar un producto que precipite y que tenga color visible. El sustrato o reactivo de captura puede ser un metal pesado o un colorante. Azul Rojo Naranja/Amarillo
Impregnación argenica: Sales de plata. La plata se reduce y se precipita en las células del tejido. Técnicas inmunocitoquimicas Uso de anticuerpos específicos para: Localizar proteínas de la MEC Proteínas del cito esqueleto Receptores de membrana o citosolicos Enzimas citosolicas Marcadores de diferenciación Proteínas nucleares Enzimas participantes en la apoptosis Algunas hormonas Técnica directa: Anticuerpo primario acoplada con un fluorocromo (enzima) que permite su visualización por medio de una reacción enzimática. Técnica indirecta: Anticuerpo primario unido a su antígeno en el tejido, con otro anticuerpo de otra especie que le reconoce (Anticuerpo secundario marcado con fluorocromo) Hibridacion insitu: Permite identificar la presencia de ARN mensaje e incluso genes. Se emplean sondas moleculares (Ejemplo ADN bicatenarios, pequeñas porciones de ácidos nucleicos)
Técnicas para el estudio del sistema nervioso.
(Solo las que considero mas importantes) Técnica de Cajal: Nitrato de plata que luego se reduce. El precipitado de plata ocurre sobre los neurofilamentos. Se tiñen las neuronas de color marrón, no se tiñe el núcleo. (Básicamente se tiñen todas las partes de la neurona que tienen presencia de neurofilamentos) Técnica de Golgi: Bicromato de potasio, tetroxido de osmio impregnado con nitrato de plata. Tiñe el 10% de las neuronas de color negro. (Somas y prolongaciones) Inmunoenzimaticas Inmunofluorescencia Radioautografia Para estudiar la duplicación celular, el ciclo secretor y distintos eventos celulares dinámicos, mediante la incorporación in vivo de sustratos a los cuales se les unen isotopos radioactivos.