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CÁTEDRA "B" DE CITOLOGÍA, HISTOLOGÍA Y EMBRIOLOGÍA – F.C.M. – U.N.L.P.
Autor Responsable: Prof. Marhta VIDAL - Diseño y Edición Pablo DEGREGORI
® Cátedra “B” de Citología, Histología y Embriología. Facultad de Ciencias Médicas. U.N.L.P. 201 5. Reserva de derechos. Quedan reservados todos los derechos de propiedad intelectual, diseños e imágenes contenidas en estas páginas. Queda totalmente prohibida cualquier copia o reproducción total o parcial de dicha edición por cualquier medio del contenido sin la autorización previa, expresa y por escrito de la Cátedra.
OBJETIVOS DE LA MATERIA
Formar un estudiante que posea conocimientos de Citología, Histología y Embriología en un nivel adecuado y suficientemente actualizado, capaz de interpretar los fenómenos dinámicos de la Histofisiología y del desarrollo embriológico del hombre.
Desarrollar en el alumno la capacidad de observación, de análisis y síntesis, de comparación y de crítica, para poder resolver los problemas que se le planteen. Así se podrá llegar, mediante la discusión inteligente y bien fundamentada, a un conocimiento más sólido y perdurable.
Contribuir a una profunda formación científica general, preparando al estudiante para saber categorizar los valores éticos y desarrollar el sentido de la responsabilidad.
HISTO: tejido
LOGOS: estudio, palabra o aprendizaje.
El fundamento de nuestras actividades prácticas, será familiarizar a los alumnos con el estudio microscópico de las estructuras normales , de los distintos órganos de la economía; interrelacionarlos; comprender sus funciones (Fisiología) y concluir en la posibilidad de que existan alteraciones morfológicas y/o funcionales, de los mismos (Fisiopatología), intentando capacitarlos para su futura introducción al estudio de las enfermedades (Patología) , las cuales se expresan mediante signos y síntomas que se estudian en la Clínica Médica.
Toda metodología didáctica que nos permita concretar lo fundamentado anteriormente, será valida.
TECNICA HISTOLOGICA
Con más de cien años de existencia, se ha ido perfeccionando con el paso del tiempo. Esta técnica debe estudiar una capa muy delgada de la muestra, susceptible de ser observada, por transparencia, en el microscopio , conservando :
- La forma y tamaño , lo más exactamente posible.
- La estructura de las células y los tejidos.
Para conciliar estas dos exigencias, las piezas a estudiar deben sufrir un cierto número de procedimientos, que comprenderán ciertas etapas o pasos. Para ello proponemos a los alumnos, las siguientes Unidades de Acción: A. Nombre los pasos de la Técnica Histológica, para el examen mediato (Técnica Corriente) B. En la obtención de material , discuta la diferencia entre Necropsia y Biopsia. C. Nombre los animales de laboratorio mas comúnmente utilizados, para la obtención de material de estudio. D. Explique la importancia de la fijación. E. Dé ejemplos de Fijadores Físicos , Fijadores Químicos y Mezclas Fijadoras más comunes. F. Nombre el Fijador Químico más común. G. Establezca la importancia de la INCLUSIÓN. H. Mencione la sustancia que se usa comúnmente para la inclusión y los pasos utilizados para la misma.
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I. Mencione el espesor de los cortes que se utilizan en microscopia óptica ; compárelos con el espesor exigido en microscopia electrónica. J. Explique brevemente el montaje. K. Se discutirá, en forma practica, la orientación de los cortes. Los diferentes planos en que pueden ser cortados : Célula-Órgano Hueco-Órgano Macizo. L. Defina qué es un Colorante. M. Establezca la diferencia entre Coloración e Impregnación. N. Dé ejemplos de los colorantes más utilizados. O. Establezca diferencias y relaciones entre los siguientes términos: BASÓFILO ACIDÓFILO (EOSINOFILO) ESTRUCTURA BASICA ESTRUCTURA ÁCIDA P. Mencione la Coloración Dicrómica , más común; analice sus pasos. Q. Nombre algunas técnicas Tricrómicas. R. ¿Qué entiende por Metacromasia? S. Mencione algún Colorante Metacromático.
Nuestra Cátedra de Citología, Histología y Embriología tiene como principal objetivo a lo largo y a través de nuestras actividades practicas, orientar a cada estudiante a comprender la microanatomía de las células, los tejidos y los órganos que ellos constituyen, pudiendo así correlacionar la estructura y la función.
El estudio directo de células y tejidos vivos solo tiene aplicaciones limitadas, presentando los tejidos, en este estado, cierto espesor que dificulta el paso de la luz a través de ellos. Por lo que se utiliza con mayor frecuencia el estudio de tejidos muertos obtenidos por biopsia o necropsia (autopsia) y mantenidos a través de diversas acciones químicas, a las que son sometidos de forma inmediata a su extracción.
El material se ha obtenido en algunos casos por biopsia, por ejemplo: piel, pero en mayor número por necropsia de animales de laboratorio (rata, perro, gato, conejo, mono, etc.) o del hombre. Puede tratarse de: un órgano entero o mas comúnmente un trozo o fragmento del órgano. Siempre se realiza con instrumental quirúrgico y con el debido conocimiento anatomotopográfico.
De las diversas acciones químicas para preparar y preservar este material de estudio, el primer paso esta marcado por la acción fijadora de ciertos agentes químicos (individuales o mezclas). Los fijadores conservan la estructura de las células y de los componentes extracelulares deteniendo el metabolismo celular, es decir, frenando la autólisis y estabilizando las proteínas. El fijador químico individual mas utilizado es el formol, solución acuosa de formaldehído al 37%, el formol es un mal fijador de las membranas plasmáticas pues no reacciona con los lípidos. La mezcla fijadora mas utilizada es la de Bouin (formol, ácido acético y ácido pícrico). Si bien no los utilizamos en el material que examinamos en nuestros trabajos prácticos, recordemos que también hay fijadores físicos: frío, calor, congelación y desecación.
El segundo paso es infiltrar o incluir la muestra con la finalidad de permitir cortes muy delgados y la sustancia de inclusión empleada es la parafina debido a sus condiciones de penetrabilidad y consistencia. Por lo tanto al retirar la muestra de la solución fijadora, se deberá lavar y luego: a) deshidratar lenta y progresivamente en soluciones alcohólicas de concentración creciente: 70% - 80 a 90% - hasta llegar al alcohol absoluto (100%). Se quita el agua de células y tejidos que componen la muestra, porque la parafina no será miscible ni en agua ni en alcohol. b) se procederá luego a la aclaración utilizando un solvente orgánico como el xileno, miscible tanto en alcohol como en parafina, por lo tanto es reemplazado el alcohol absoluto.
Finalmente sobreviene la imbibición en parafina fundida (estufa a 60º), que deberá ocupar todos los espacios entre las células y en el interior de las mismas. Al retirar de la estufa la parafina fundida, se enfría y endurece formando un bloque de tamaño adecuado: taco , el cual se coloca en aparato de
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La inmunohistoquímica nos permite reconocer células del páncreas endocrino y células de la adenohipófisis, son técnicas muy específicas que mostramos ocasionalmente en nuestras actividades prácticas.
El organismo reacciona ante sustancias extrañas (antígenos) y forma anticuerpos (proteínas específicas) que sintetizan y secretan células del tejido conectivo (plasmocitos).
En el laboratorio un anticuerpo se conjuga o une químicamente a un colorante fluorescente por ejemplo fluoresceína, este reactivo se aplica a cortes de tejidos fijados débilmente y luego colocados sobre portaobjetos y detectan al antígeno en células y tejidos (los hace visibles). La especificidad de la reacción entre el antígeno (Ag) y el anticuerpo (Ac), es el fundamento de la inmunocitoquímica. Además de esta técnica de anticuerpo fluorescente , se puede utilizar otra técnica como la histoquímica enzimática , en la cual al anticuerpo se le adosa la enzima peroxidasa (en lugar de la fluoresceína), pudiéndose identificar complejos antígeno-anticuerpo mediante la determinación enzimohistoquímica de la peroxidasa, fundamento de algunos cortes de tejido glandular endocrino que incorporamos en trabajos prácticos.
MICROSCOPIO ÓPTICO
MICROSCOPIO ÓPTICO O DE LUZ (COMPUESTO) : denominado compuesto por estar constituido por dos sistemas de lentes. (OBJETIVO Y OCULAR)
PARTE MECÁNICA O ESTATICO
- TUBO
- REVÓLVER PORTAOBJETIVO
- COLUMNA O BRAZO
- PLATINA
- PIE O BASE
- TORNILLO MACROMETRICO
- TORNILLO MICROMETRICO
PARTE ÓPTICA
- OCULAR/ES
- OBJETIVO/S
- APARATO DE ILUMINACIÓN
- ESPEJO
- CONDENSADOR
- DIAFRAGMA
En este esquema, asigne cada componente del Microscopio Compuesto con el nombre correcto.
MICROSCOPIA Y TECNICAS DE ENFOQUE – H
TUBO : sostiene el sistema de lentes, Ocular/es en su parte superior y Objetivos en la inferior
(acoplados alsistema revólver). Su longitud es de 160 mm; puede portar uno o más Oculares. Puede
ser Vertical u Oblicuo, determinando el eje del microscopio.
COLUMNA O BRAZO : es la parte que sostiene al Tubo y a la Platina ; permite trasladar el microscopio. Se articula con el Tubo, permitiendo a éste, movimientos de ascenso y descenso (con la utilización de los tornillos de enfoque).
PLATINA : es una pieza metálica, de forma diversa (rectangular, circular o cuadrada). Dispuesta en forma perpendicular al eje óptico, sirve de apoyo al preparado, para su observación. Está provista de un orificio central, el cual permite el paso de los rayos de luz procedentes del aparato de iluminación, situado por debajo de ella. Puede ser fija , con pinzas que sujeten el preparado, el cual tendrá que ser desplazado manualmente para observar distintos campos; puede ser móvil. Algunos modelos más modernos tienen la posibilidad, a través de un sistema de tornillos, de imprimirle al objeto coloreado (preparado) desplazamientos anteroposteriores y de derecha a izquierda.
PIE O BASE : base de sustentación del aparato , siendo diversa su forma.
SISTEMA REVÓLVER : disco giratorio adosado al borde inferior del tubo, donde se atornillan los distintos objetivos.
TORNILLO MACROMÉTRICO : como su nombre lo dice es el de mayor tamaño. Permite desplazamientos rápidos de aproximación (que se observan a simple vista)
TORNILLO MICROMÉTRICO : permite realizar movimientos imperceptibles, posibilitando el enfoque de detalles finos (el enfoque definitivo del preparado); el desplazamiento del tubo no pasa de unos 3mm. Su mecanismo es muy delicado y no debe forzarse, razón por la cual conviene comenzar el trabajo colocándolo en la mitad de su recorrido
Dichos tornillos se encuentran en la columna, a ambos lados del microscopio, permitiendo desplazamientos a expensas del tubo. En otros modelos más modernos, los sistemas de enfoque rápido y lento se encuentran en un solo tornillo; y en ellos es la platina la que asciende y desciende.
OCULAR/ES : cilindro hueco metálico, ubicado en el extremo superior del Tubo, con una lente o sistema de lentes convergentes, en cada extremo. La Lente Ocular es la más próxima al ojo del observador y la Lente Colectora o de Campo es la inferior (recibiendo directamente los rayos provenientes del objetivo). Aumenta sólo la imagen producida (en su plano focal) por el objetivo, pero sin agregar nuevos detalles y corrigiendo defectos de la imagen.
OBJETIVO/S : por su aplicación pueden ser: A. A seco : constituidos por un sistema de lentes, una principal y cercana al objeto (preparado), que es la Lente Frontal , responsable del aumento del objetivo. Las otras son lentes simples, dispuestas en dobletes o tripletes , unidas entre sí por una sustancia transparente; corrigen los defectos (aberraciones). Al usar estas lentes, se interpone aire entre la lente frontal y el preparado. B. De inmersión : permiten los mayores aumentos y pueden ser para agua, glicerina o aceite; los más utilizados son los de inmersión en aceite (sintético o de cedro ). Para evitar que una gran cantidad de rayos luminosos, que atraviesan el portaobjeto, se desvíen (difracción), al salir del mismo es que se coloca una gota de aceite de cedro sobre el preparado, ya que el aceite tiene un índice de refracción muy próximo al del vidrio. Aquí se interpone aceite, entre la lente frontal y el preparado.
MICROSCOPIA Y TECNICAS DE ENFOQUE – H
trate de que los rayos reflejados se dirijan al eje óptico del microscopio; a partir de esto, no mueva el microscopio de su lugar. D. Tome el preparado y compruebe que esté limpio, fíjese si tiene huellas digitales o polvo, en caso de haberlas, límpielas con un pañuelo. E. Coloque el Preparado sobre la Platina y sujételo con las pinzas; tenga en cuenta que el Cubreobjeto este hacia arriba, mirando hacia el Objetivo. F. Mueva el Preparado de tal manera, que el material de estudio (objeto coloreado), esté aproximadamente sobre el orificio de la Platina. G. Baje el Tubo mediante movimientos hacia adelante del tornillo macrométrico, mirando lateralmente desde afuera , hasta que la lente frontal del Objetivo esté a 2 - 4 mm del cubreobjeto. H. Mire por el ocular , mientras sube el Tubo hasta obtener una imagen clara del objeto. Subirá el Tubo moviendo el tornillo macrométrico, lentamente siempre atrás. Trate de observar siempre por el ocular con un ojo, mientras mantiene el otro abierto; al principio resultará difícil (porque verá tanto el preparado como la mesa), pero luego le será más cómodo. I. Regule con el tornillo micrométrico para lograr la imagen más nítida posible; mueva dicho tornillo hacia delante o atrás, lentamente. J. Recorra el preparado moviéndolo con los dedos o con los tornillos de la Platina móvil , si la hubiere, mientras observa por el ocular en caso de que el Objeto quede fuera de foco. Cuando realiza el movimiento, regule con el tornillo micrométrico. K. Para observar a mayor aumento , gire el revólver hasta colocar, en el eje óptico, el objetivo de
mayor aumento. Fíjese que quede trabado por el reten (se tacta unclick)
L. Observe por el ocular , mientras regula con el tornillo micrométrico para obtener una buena imagen. Queda totalmente prohibido utilizar el tornillo macrométrico, para regular a mayor aumento. Generalmente para colocar en foco, al pasar de menor aumento, a mayor, debe moverse el tornillo micrométrico hacia atrás. M. Recorra el preparado de la misma manera que a menor aumento, mientras enfoca con el tornillo micrométrico, pues el movimiento del preparado a mayor aumento, hace que el objeto salga de foco frecuentemente.
CONCLUSIONES
- Deberá iniciarse la técnica de enfoque colocando el objetivo de menor aumento mediante el recorrido de diferentes áreas (y la observación de distintas estructuras). Se efectuará un diagnóstico histológico del corte. Corroborar que el cubreobjetos este hacia arriba.
- Los movimientos de descenso del Tubo (mediante el tornillo macrométrico de enfoque rápido ) buscando aproximar el objetivo al preparado (ubicado en la Platina ), deben realizarse mirando desde afuera, para evitar la ruptura del preparado.
- Al colocar el objetivo de mayor aumento , para observar con mayor detalle algunas estructuras no debe accionarse el tornillo macrométrico.
NOTA : se aclara que la técnica de enfoque que aquí se describe, ha sido adecuada al estado de conservación de nuestros microscopios. Actualmente en la mayoría de nuestros microscopios, la platina es la que se mueve (ascenso y descenso)
Recuerde que los malos resultados en la observación, pueden deberse a: A. En la iluminación: Espejo en posición incorrecta. Condensador bajo. Diafragma cerrado.
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Una iluminación eficiente es la que se obtiene cuando el campo se ve homogéneamente iluminado, sin sombras ni puntos más luminosos. B. En el enfoque: Preparado mal centrado que no coincida con el eje óptico del microscopio. Objetivo mal fijado, en el reten. Preparado al revés, cubreobjeto para abajo. Lentes sucias. Movimientos de Tubo muy rápidos. Tornillo micrométrico en el tope de su recorrido.
C. En el preparado: que este sucio.
NOTA: algunos de nuestros microscopios poseen un tornillo de enfoque único, el cual es de definición intermedia entre el macro y el micrométrico; en ellos la Platina es la que asciende y desciende.
Debemos recalcar que el objetivo es el responsable del límite o poder de resolución y el ocular es el responsable de la ampliación de la imagen (ampliación total del objeto observado), la que se obtiene multiplicando el aumento del objetivo por el aumento del ocular.
¿Qué se entiende por Poder Resolutivo?
Compare el Poder Resolutivo del MO y ME con el del ojo humano.
UNIDADES DE MEDIDA:
MACROSCÓPICO:
Metro (m)
Milímetro (mm) = 0,001 m (1 mm); es la milésima parte del Metro.
MICROSCÓPICO:
Micrón ( ) o Micrómetro ( m) = 0,001 mm (1 m); es la milésima parte del Milímetro.
SUBMICROSCÓPICO:
Milimicrón (m ) o Nanómetro ( m) = 0,001 (1 m); es la milésima parte del Micrón.
Ángstrom (A) = 0,0001 m; es la diezmilésima parte del Micrón.
