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Cátedra de Citología, Histología y Embriología - F.C.M - U.N.L.P Autor Responsable: Prof. Marhta VIDAL - Diseño y Edición Pablo DEGREGORI ® Cátedra de Citología, Histología y Embriología. Facultad de Ciencias Médicas. U.N.L.P. 20 21. Reserva de derechos. Quedan reservados todos los derechos de propiedad intelectual, diseños e imágenes contenidas en estas páginas. Queda totalmente prohibida cualquier copia o reproducción total o parcial de dicha edición por cualquier medio del contenido sin la autorización previa, expresa y por escrito de la Cátedra.
OBJETIVOS DE LA MATERIA
Formar un estudiante que posea conocimientos de Citología, Histología y Embriología en un nivel adecuado y suficientemente actualizado, capaz de interpretar los fenómenos dinámicos de la Histofisiología y del desarrollo embriológico del hombre. Desarrollar en el alumno la capacidad de observación, de análisis y síntesis, de comparación y de crítica, para poder resolver los problemas que se le planteen. Así se podrá llegar, mediante la discusión inteligente y bien fundamentada, a un conocimiento más sólido y perdurable. Contribuir a una profunda formación científica general, preparando al estudiante para saber categorizar los valores éticos y desarrollar el sentido de la responsabilidad.
HISTO: tejido
LOGOS: estudio, palabra o aprendizaje.
El fundamento de nuestras actividades prácticas, será familiarizar a los alumnos con el estudio microscópico de las estructuras normales , de los distintos órganos de la economía; interrelacionarlos; comprender sus funciones (Fisiología) y concluir en la posibilidad de que existan alteraciones morfológicas y/o funcionales, de los mismos (Fisiopatología), intentando capacitarlos para su futura introducción al estudio de las enfermedades (Patología) , las cuales se expresan mediante signos y síntomas que se estudian en la Clínica Médica. Toda metodología didáctica que nos permita concretar lo fundamentado anteriormente, será valida.
TÉCNICA HISTOLÓGICA
Con más de cien años de existencia, se ha ido perfeccionando con el paso del tiempo. Esta técnica debe estudiar una capa muy delgada de la muestra, susceptible de ser observada, por transparencia, en el microscopio , conservando :
- La forma y tamaño , lo más exactamente posible.
- La estructura de las células y los tejidos. Para conciliar estas dos exigencias, las piezas a estudiar deben sufrir un cierto número de procedimientos, que comprenderán ciertas etapas o pasos. Para ello proponemos a los alumnos, las siguientes Unidades de Acción: A. Nombre los pasos de la Técnica Histológica, para el examen mediato (Técnica Corriente) B. En la obtención de material , discuta la diferencia entre Necropsia y Biopsia. C. Nombre los animales de laboratorio mas comúnmente utilizados, para la obtención de material de estudio. D. Explique la importancia de la fijación. E. Dé ejemplos de Fijadores Físicos , Fijadores Químicos y Mezclas Fijadoras más comunes. F. Nombre el Fijador Químico más común. G. Establezca la importancia de la INCLUSIÓN. H. Mencione la sustancia que se usa comúnmente para la inclusión y los pasos utilizados para la misma. I. Mencione el espesor de los cortes que se utilizan en microscopia óptica ; compárelos con el espesor exigido en microscopia electrónica.
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J. Explique brevemente el montaje. K. Se discutirá, en forma practica, la orientación de los cortes. Los diferentes planos en que pueden ser cortados : Célula-Órgano Hueco-Órgano Macizo. L. Defina qué es un Colorante. M. Establezca la diferencia entre Coloración e Impregnación. N. Dé ejemplos de los colorantes más utilizados. O. Establezca diferencias y relaciones entre los siguientes términos:
- BASÓFILO
- ACIDÓFILO (EOSINOFILO)
- ESTRUCTURA BASICA
- ESTRUCTURA ÁCIDA P. Mencione la Coloración Dicrómica , más común; analice sus pasos. Q. Nombre algunas técnicas Tricrómicas. R. ¿Qué entiende por Metacromasia? S. Mencione algún Colorante Metacromático. Nuestra Cátedra de Citología, Histología y Embriología tiene como principal objetivo a lo largo y a través de nuestras actividades practicas, orientar a cada estudiante a comprender la microanatomía de las células, los tejidos y los órganos que ellos constituyen, pudiendo así correlacionar la estructura y la función. El estudio directo de células y tejidos vivos solo tiene aplicaciones limitadas, presentando los tejidos, en este estado, cierto espesor que dificulta el paso de la luz a través de ellos. Por lo que se utiliza con mayor frecuencia el estudio de tejidos muertos obtenidos por biopsia o necropsia (autopsia) y mantenidos a través de diversas acciones químicas, a las que son sometidos de forma inmediata a su extracción. El material se ha obtenido en algunos casos por biopsia, por ejemplo: piel, pero en mayor número por necropsia de animales de laboratorio (rata, perro, gato, conejo, mono, etc.) o del hombre. Puede tratarse de: un órgano entero o mas comúnmente un trozo o fragmento del órgano. Siempre se realiza con instrumental quirúrgico y con el debido conocimiento anatomotopográfico. De las diversas acciones químicas para preparar y preservar este material de estudio, el primer paso esta marcado por la acción fijadora de ciertos agentes químicos (individuales o mezclas). Los fijadores conservan la estructura de las células y de los componentes extracelulares deteniendo el metabolismo celular, es decir, frenando la autólisis y estabilizando las proteínas. El fijador químico individual mas utilizado es el formol, solución acuosa de formaldehído al 37%, el formol es un mal fijador de las membranas plasmáticas pues no reacciona con los lípidos. La mezcla fijadora mas utilizada es la de Bouin (formol, ácido acético y ácido pícrico). Si bien no los utilizamos en el material que examinamos en nuestros trabajos prácticos, recordemos que también hay fijadores físicos: frío, calor, congelación y desecación. El segundo paso es infiltrar o incluir la muestra con la finalidad de permitir cortes muy delgados y la sustancia de inclusión empleada es la parafina debido a sus condiciones de penetrabilidad y consistencia. Por lo tanto al retirar la muestra de la solución fijadora, se deberá lavar y luego: a) deshidratar lenta y progresivamente en soluciones alcohólicas de concentración creciente: 70% - 80 a 90% - hasta llegar al alcohol absoluto (100%). Se quita el agua de células y tejidos que componen la muestra, porque la parafina no será miscible ni en agua ni en alcohol. b) se procederá luego a la aclaración utilizando un solvente orgánico como el xileno, miscible tanto en alcohol como en parafina, por lo tanto es reemplazado el alcohol absoluto. Finalmente sobreviene la imbibición en parafina fundida (estufa a 60º), que deberá ocupar todos los espacios entre las células y en el interior de las mismas. Al retirar de la estufa la parafina fundida, se enfría y endurece formando un bloque de tamaño adecuado: taco , el cual se coloca en aparato de gran precisión, provisto de una cuchilla de acero: Micrótomo , el mismo se encargará de efectuar cortes lo suficientemente delgados (5- 10 μm de espesor) que permitan el paso de la luz a través de ellos. Para acceder a la tercera etapa que es la coloración, observar el corte histológico al microscopio óptico y examinarlo en detalle, habrá que disolver y extraer la parafina utilizando nuevamente al xileno.
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El organismo reacciona ante sustancias extrañas (antígenos) y forma anticuerpos (proteínas específicas) que sintetizan y secretan células del tejido conectivo (plasmocitos). En el laboratorio un anticuerpo se conjuga o une químicamente a un colorante fluorescente por ejemplo fluoresceína, este reactivo se aplica a cortes de tejidos fijados débilmente y luego colocados sobre portaobjetos y detectan al antígeno en células y tejidos (los hace visibles). La especificidad de la reacción entre el antígeno (Ag) y el anticuerpo (Ac), es el fundamento de la inmunocitoquímica. Además de esta técnica de anticuerpo fluorescente , se puede utilizar otra técnica como la histoquímica enzimática , en la cual al anticuerpo se le adosa la enzima peroxidasa (en lugar de la fluoresceína), pudiéndose identificar complejos antígeno-anticuerpo mediante la determinación enzimohistoquímica de la peroxidasa, fundamento de algunos cortes de tejido glandular endocrino que incorporamos en trabajos prácticos. Los microscopios son los instrumentos que permiten identificar las características generales y particulares de: células, tejidos y órganos. Aumentan el tamaño de una imagen lo cual permite ver detalles de la misma, imposibles de observar a simple vista. Existen muchos tipos de microscopios como por ejemplo:
MICROSCOPIOS ÓPTICOS
- SIMPLE: Lupa
- COMPUESTOS, DE LUZ O DE CAMPO CLARO: la muestra se observa más oscura que el campo que la rodea (son los que se utilizan en el aula de trabajos prácticos).
- ESTEREOSCÓPICOS: permiten ver las muestras en dos y tres dimensiones.
- DE LUZ ULTRAVIOLETA: la imagen depende de la absorción de la luz UV, por las moléculas de la muestra.
- DE LUZ POLARIZADA: presenta modificaciones del M/O: entre la fuente de luz y la muestra se coloca un filtro (polarizador) y entre el objetivo y el observador un segundo filtro (analizador).
- DE CAMPO OSCURO: para observar microorganismos; tiene un condensador especial que hace que los rayos luminosos no penetren directamente sino en forma oblicua, es decir la luz se dispersa o refracta por las estructuras del espécimen.
- DE CONTRASTE DE FASES: se utiliza para células vivas, es decir en cultivos. Se basa en modificaciones de la trayectoria de los rayos de luz, provocando contrastes notables en la preparación.
- DE FLUORESCENCIA: el material biológico es tratado con flurocromos, emite luz propia.
- CONFOCAL DE BARRIDO: combina componentes de un microscopio de campo claro con un sistema de barrido para disecar ópticamente una muestra.
MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS
- DE TRANSMISION (MET): con poder de resolución de 0 ,1 a 0,2 nm. Permite observar la ultraestructura de cortes finos de las células.
- DE BARRIDO (MEB) O SCANNING: con poder de resolución de 10 nm. Se observan superficies de células y de tejidos.
- DE FUERZA ATOMICA (MFA): con resolución molecular y atómica. Es un microscopio no óptico. Es una sonda exploradora puntiaguda, en su extremo (púa) que contacta la muestra o puede subir y bajar, de acuerdo a las irregularidades de la superficie de la muestra biológica (la muestra puede estar en el agua).
MICROSCOPIO ÓPTICO
MICROSCOPIO ÓPTICO O DE LUZ (COMPUESTO) : denominado compuesto por estar constituido por dos sistemas de lentes. (OBJETIVO Y OCULAR). Agrandando las imágenes de pequeños objetos.
MICROSCOPÍA Y TÉCNICAS DE ENFOQUE – H 01
Esquema que asigna cada componente del Microscopio Compuesto. PARTE MECÁNICA O ESTATICO
- TUBO
- REVÓLVER PORTAOBJETIVO
- COLUMNA O BRAZO
- PLATINA
- PIE O BASE
- TORNILLO MACROMETRICO
- TORNILLO MICROMETRICO PARTE ÓPTICA
- OCULAR/ES
- OBJETIVO/S
- APARATO DE ILUMINACIÓN
- ESPEJO
- CONDENSADOR
- DIAFRAGMA TUBO : sostiene el sistema de lentes, Ocular/es en su parte superior y Objetivos en la inferior
(acoplados al sistema revólver). Su longitud es de 160 mm; puede portar uno o más Oculares. Puede
ser Vertical u Oblicuo, determinando el eje del microscopio. COLUMNA O BRAZO : es la parte que sostiene al Tubo y a la Platina ; permite trasladar el microscopio. Se articula con el Tubo, permitiendo a éste, movimientos de ascenso y descenso (con la utilización de los tornillos de enfoque). FIG.1.
MICROSCOPÍA Y TÉCNICAS DE ENFOQUE – H 01
LECTURA DE UN OBJETIVO
OBJETIVO DE X 25 (planocromático) OBJETIVO APERTURA NUMÉRICA = 0, º = Seno del semiángulo TUBO = 160 mm de abertura CUBREOBJETO DE 0,17 mm de espesor PORTA OBJETO APERTURA NUMÉRICA (A.N.) : la abertura numérica de un objetivo representa la cantidad máxima de rayos que la Lente Frontal puede captar; la misma viene grabada en los objetivos. A mayor abertura numérica del objetivo, mayor nitidez de la imagen. Responde a la siguiente fórmula : A.N. = n x senμ , lo cual significa que el índice de refracción (n), del medio que se encuentra entre el objeto o preparado y la lente frontal del objetivo, se multiplica por el seno (sen) de la mitad del ángulo del cono de la luz que entra en el objetivo. Dicho ángulo está determinado por los rayos lumínicos más periféricos. ESPEJO : por lo general se encuentra sostenido a la columna, con movimientos en todas direcciones; otros modelos de microscopio tienen el espejo en la base o pie. El espejo de cara plana se utiliza cuando la luz es excesiva y el espejo de cara cóncava se utiliza para captar la mayor cantidad de rayos luminosos, cuando la luz es débil. CONDENSADOR : concentra los rayos luminosos reflejados por el espejo y los proyecta sobre el preparado, con un ángulo de incidencia apropiado para que atraviesen la Lente Frontal del objetivo. En definitiva, es un conjunto de lentes que aumentan la intensidad luminosa, desviando los rayos de luz de una zona relativamente extensa hacia una reducida. El Condensador debe estar alto, es decir lo más cerca de la platina posible, por lo tanto lo más cercano al Objeto. En algunos microscopios se puede acercar o alejar el Condensador con los movimientos de un tornillo que se ubica a un lado de la Columna. DIAFRAGMA : generalmente acompaña a los Condensadores, pero puede ser independiente. Regula la apertura del Condensador. MANEJO DEL M/O (TÉCNICA DE ENFOQUE) A. Ubíquese frente al microscopio, de manera cómoda. Puede inclinar la Columna hacia usted, si el microscopio lo permite. B. Ponga en posición correcta:
- Mediante el revólver el Objetivo de menor aumento situado en el eje óptico y fijado por el retén del revólver.
- Fuente luminosa artificial, situada a 20 – 30 cm del espejo.
- El espejo con la cara cóncava, hacia la fuente de luz.
- El condensador colocado en la posición más alta (muy cerca de la Platina)
- El diafragma completamente abierto. C. Efectúe las operaciones necesarias para que el campo quede completamente iluminado y con la mayor intensidad que le sea posible conseguir; para ello proceda bajando el Tubo hasta que la lente frontal del Objetivo este a 1 cm de la Platina. Observe por el Ocular, moviendo el espejo y trate de que los rayos reflejados se dirijan al eje óptico del microscopio; a partir de esto, no mueva el microscopio de su lugar. D. Tome el preparado y compruebe que esté limpio, fíjese si tiene huellas digitales o polvo, en caso de haberlas, límpielas con un pañuelo. E. Coloque el Preparado sobre la Platina y sujételo con las pinzas; tenga en cuenta que el Cubreobjeto este hacia arriba, mirando hacia el Objetivo.
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F. Mueva el Preparado de tal manera, que el material de estudio (objeto coloreado), esté aproximadamente sobre el orificio de la Platina. G. Baje el Tubo mediante movimientos hacia adelante del tornillo macrométrico, mirando lateralmente desde afuera , hasta que la lente frontal del Objetivo esté a 2 - 4 mm del cubreobjeto. H. Mire por el ocular , mientras sube el Tubo hasta obtener una imagen clara del objeto. Subirá el Tubo moviendo el tornillo macrométrico, lentamente siempre atrás. Trate de observar siempre por el ocular con un ojo, mientras mantiene el otro abierto; al principio resultará difícil (porque verá tanto el preparado como la mesa), pero luego le será más cómodo. I. Regule con el tornillo micrométrico para lograr la imagen más nítida posible; mueva dicho tornillo hacia delante o atrás, lentamente. J. Recorra el preparado moviéndolo con los dedos o con los tornillos de la Platina móvil , si la hubiere, mientras observa por el ocular en caso de que el Objeto quede fuera de foco. Cuando realiza el movimiento, regule con el tornillo micrométrico. K. Para observar a mayor aumento , gire el revólver hasta colocar, en el eje óptico, el objetivo de
mayor aumento. Fíjese que quede trabado por el reten (se tacta un click)
L. Observe por el ocular , mientras regula con el tornillo micrométrico para obtener una buena imagen. Queda totalmente prohibido utilizar el tornillo macrométrico, para regular a mayor aumento. Generalmente para colocar en foco, al pasar de menor aumento, a mayor, debe moverse el tornillo micrométrico hacia atrás. M. Recorra el preparado de la misma manera que a menor aumento, mientras enfoca con el tornillo micrométrico, pues el movimiento del preparado a mayor aumento, hace que el objeto salga de foco frecuentemente. CONCLUSIONES
- Deberá iniciarse la técnica de enfoque colocando el objetivo de menor aumento mediante el recorrido de diferentes áreas (y la observación de distintas estructuras). Se efectuará un diagnóstico histológico del corte. Corroborar que el cubreobjetos este hacia arriba.
- Los movimientos de descenso del Tubo (mediante el tornillo macrométrico de enfoque rápido ) buscando aproximar el objetivo al preparado (ubicado en la Platina ), deben realizarse mirando desde afuera, para evitar la ruptura del preparado.
- Al colocar el objetivo de mayor aumento , para observar con mayor detalle algunas estructuras no debe accionarse el tornillo macrométrico. NOTA : se aclara que la técnica de enfoque que aquí se describe, ha sido adecuada al estado de conservación de nuestros microscopios. Actualmente en la mayoría de nuestros microscopios, la platina es la que se mueve (ascenso y descenso) Recuerde que los malos resultados en la observación, pueden deberse a: A. En la iluminación:
- Espejo en posición incorrecta.
- Condensador bajo.
- Diafragma cerrado. Una iluminación eficiente es la que se obtiene cuando el campo se ve homogéneamente iluminado, sin sombras ni puntos más luminosos.
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UNIDADES DE MEDIDA:
MACROSCÓPICO:
Metro (m)
Milímetro (mm) = 0,001 m (1 mm); es la milésima parte del Metro.
MICROSCÓPICO:
Micrón ( ) o Micrómetro ( m) = 0,001 mm (1 m); es la milésima parte del Milímetro.
SUBMICROSCÓPICO:
Milimicrón (m ) o Nanómetro ( m) = 0,001 (1 m); es la milésima parte del Micrón. Ǻngstrom (A) = 0,0001 m; es la diezmilésima parte del Micrón.
Picómetro (pm) = 0,01Ǻngstrom.
MICROSCOPÍA Y TÉCNICAS DE ENFOQUE – H 01
IMÁGENES QUE REPRESENTAN ALGUNOS EJEMPLOS DE TÉCNICAS HISTOLÓGICAS
HEMATOXILINA - EOSINA (HE) 600X
ORO SUBLIMADO DE CAJAL 200X
CEREBELO
CEREBELO
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PAS/ORANGE 600X
MALLORY-AZÁN TRICRÓMICO (M-AZAN) 600X
HIPÓFISIS
RIÑÓN
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ORCEÍNA 200X
ALDEHIDO FUCSINA 8 00X
CARTÍLAGO ELÁSTICO
ARTERIA AORTA
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AZUL LUXOL – VIOLETA DE CRESILO 8 00X
CAPA POLIMORFA – CORTEZA CEREBRAL
GANGLIO LINFÁTICO
