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TEMA 2: MICROSCOPÍA Y TINCIONES.
Las muestras son primero observadas al microscopio óptico (MO) y luego al microscopio electrónico (ME) Así se obtiene una buena imagen de la muestra que depende del aumento, contraste y resolución.
AUMENTO: Es producido por los objetivos, que son lentes convexas (más gruesa por el centro que por los extremos). Los rayos de luz son afectados por la refracción que cambia la dirección por el índice de refracción , estos rayos al atravesar el objeto de estudio impactan contra la lente, esta al ser más gruesa por el centro que por los extremos y al ser de vidrio cuyo índice de refracción es menor, hace que estos rayos se desvíen ciertos grados, el punto en el que coinciden todos los rayos se llama PUNTO FOCAL y la distancia de la lente al punto focal es la DISTANCIA FOCAL, a menor distancia focal, más aumento.
Distancia focal
punto focal muestra lente
CONTRASTE: Diferencia en la intensidad de la luz que nos permite apreciar una zona de la imagen diferente de otra o del fondo del campo, la mayoría de los microorganismos no tienen color, si aumentamos el contraste conseguimos verlos o otra forma es utilizar las técnicas de tinción (esta última mata al microorganismo).
RESOLUCIÓN: Es la menor distancia entre dos puntos adyacentes que pueden ser percibidos separados uno del otro, depende:
- Del tamaño de los objetivos (las lentes)
- La longitud de onda que la luz que empleemos (así se utiliza como mejor longitud de onda, el haz de electrones en ME)
- Jugando con el índice de refracción entre el objetivo y la muestra con el empleo del aceite de inmersión.
La apertura numérica (AN) depende del tamaño de la lente y el uso del aceite se define como:
AN = n sen F 07 1
Donde “n” es el índice de refracción y el sen F 07 1 es la luz que entra en forma de cono, la mitad de ese cono es el ángulo F 07 1, que depende de la distancia.
F 0 7 1 F 0 7 1
d = es la distancia entre dos puntos que se puede determinar si consideramos la longitud de onda y la AN así:
d = F 06 C / (2 AN) = F 06 C / (2 n sen F 07 1)
- ¿cuál es la distancia mínima de dos puntos (d) si utilizamos la luz azul de F 06 C = 450 nm y sabemos que el objetivo (AN) es de 0.65?
d = 450 / (2 0.65) = 346.1538.
- Objetivo débil seco = 10X
- Objetivo fuerte seco = 40X
- Objetivo de inmersión = 100X
- Oculares = 10X
Ampliación total: 100X – 400X – 1000X
MODIFICACIONES DEL MICROSCOPIO:
- Campo oscuro
- Contraste de fase
- Contraste diferencial de interferencia
- Fluorescencia.
CAMPO OSCURO F 0E 0 consiste en proyectar una potente luz sobre la muestra, que nunca llega al objetivo directamente, solo entra aquella luz reflejada por los especimenes de la muestra. Eso se consigue con un disco opaco con una ranura por donde entra la luz, el anillo se pone e el diafragma, se utiliza para ver movilidad celular (para ver estructuras móviles como flagelos).
CONTRASTE DE FASE F 0E 0 consiste en una doble modificación, se introduce otro disco opaco al diafragma pero la luz si incide en el objetivo, (diafragma anular), el objetivo tiene un anillo de fase, la luz entra e incide en la muestra y se modifica las fases de la onda luminosa. La luz que atraviesa el microorganismo se retrasa un cuarto por el índice de refracción, cuando llega al objetivo el que no a
añadiendo glutanaldehido, formaldehído o ácido ósmico y se deja enfriar, se coloca en un porta y se deja secar al aire. El frotis se extiende en un porta una gota, se aplica calor suave, luego se coloca una gota de colorante, se lava con agua el exceso y se coloca el cubre.
- DIFERENCIALES: este tipo de tinciones nos permite clasificar a la bacteria según sus propiedades a la tinción, primero hay una tinción primaria (simple), la segunda tinción es de contraste, que es añadir un colorante diferente al primero para que se tiñan todo lo que no se haya teñido antes, en este caso hay dos tipos:
•..1 tinción de Gram. F 0E 0 en este caso podemos distinguir el microorganismo, si se tiñe, es que posee una estructura en su pared celular (peptidoglicanos) que está por encima de la membrana plasmática, la llamaremos Gram. +, en el caso de las Gram. -, el peptidoglicano es muy fino y está entre la membrana plasmática y una membrana externa, en esta tinción hay un paso de decoloración: se prepara un frotis, se tiñe con cristal de violeta, se elimina el colorante en exceso, se trata con lugol que une el colorante a las células bacterianas, pasamos a decolorar lavando la muestra con etanol, se vuelve a lavar con agua, se produce la decoloración de contraste con safranina, se lava con agua y se coloca el cubre. Aquellas que cogen el primer colorante son azules y son Gram. + y las que se tiñen con el segundo son las Gram. –
•..2 ácido-alcohol resistente F 0E 0 por Zichl-neelsen. Se hizo para teñir el genero Mycobacterium (que trasmitían enfermedades como la M.tuberculosis o la M.leprae ), estas bacterias tienen una pared muy gruesa y resistente que no cogen el colorante. Prepararíamos un frotis y se trata con fucsina básica calentando la preparación, se lava con una mezcla de ácido clorhídrico y etanol, solo las micobacterias se tiñen, el resto estará decolorado, así se tiñe con azul de metileno para poder apreciar el resto de células.
- ESPECÍFICA: incrementa el contraste y revela estructuras como los flagelos, las esporas o las cápsulas. Las esporas se tiñen de una forma especial debido a que son estructuras muy duras y resistentes, casi no se tiñen, primero es hacer un frotis, se cubre la preparación y se añade el verde malaquita, se debe calentar para que coja el colorante, se lava el colorante en exceso y se vuelve a teñir con safranina para teñir a la bacteria de rojo y ver las esporas en verde en el interior. Los flagelos son estructuras que permiten el movimiento, para ello la muestra se fija con formol, se trata con ácido tánico (se hacen gruesos) y
se tiñe con rosanilina que se une al ácido tánico, la célula muere por eso solo vemos el número de flagelos y su posición.
- TINCIÓN NEGATIVA: determina estructuras que rodean a microorganismos, es el caos de los patógenos, sus cápsulas, pueden ser de diferentes tipos para ellos se hace una tinción con tinta china se extiende en un porta y se observa.
RESOLUCIÓN:
Saltamos a la microscopia electrónica, aumentamos la resolución con una longitud de onda más corta (chorro de electrones). Los microscopios son tubos grandes huecos, que proyectan los electrones, se ve a través de una pantalla, en microscopia electrónica de transmisión (MET) se ven estructuras internas mientras que en microscopia electrónica de barrido (MEB) se ve el exterior celular (forma) en una visión tridimensional. El tubo hueco o cañón, es un filamento de tungsteno, en la parte superior del microscopio, este haz pasa a través de los imanes que están en el tubo, atraviesa la muestra, aquí pasan por todos lados menos por el microorganismo, estos dan a una pantalla fluorescente y allí es donde se proyecta la imagen (MET). Se montan por una rejilla de cobre y se tiñen con metales pesados, en el interior se utilizan los métodos de criofractura y criograbado (cortes muy finos).
- Criofractura: se utiliza con todo tipo de muestras. Cogemos la muestra y se congela con nitrógeno líquido (-196ºC) así se fija, se introduce en una cámara al vacío y se calienta hasta los - ºC luego se fractura ala zar con una cuchilla, una vez rota se añade un polvo fino de platino y carbono que se deposita sobre las estructuras que están a la vista, se elimina todo lo orgánico y nos quedamos con la réplica del polvo (aquí no se ven células sino su molde).
En el caso del MEB se comporta algo diferente, su cañón proyecta los electrones primarios que inciden en la muestra que ha sido previamente recubierta con oro y así rebotan esos electrones llamándolos electrones secundarios, son recogidos y amplificados y se ven en la pantalla.
