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Practica sobre centrifugacion y bioseparaciones
Tipo: Apuntes
1 / 11
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PRÁCTICA 2:
CENTRIFUGACIÓN
FLORES ESPINOSA ABRAHAM ITSAI
MATAMOROS TOLTECA JOSELYN
PALACIOS DÍAZ CATHERINE
ROJAS HERNADEZ MARTIN
TOQUIANTZI ARZOLA TIFFANY ELIANET
poder estimar los tiempos de operación.
A continuación, se presentan los materiales, sustancias y equipos utilizados durante la
practica en la tabla 1.
4 tubos falcón para
centrifuga.
Balanza analítica Agua destilada
2 matraces Erlenmeyer de
500 mL.
Centrífuga Medio YPD
2 tapones de algodón. Microscopio Medio CN
Microtubos Cámara de Neubauer Levadura liofilizada
Baño maría con agitación Disco de esporas
Campana de extracción Solución salina de 0.85%
NaCl
En la figura 2 se muestran la serie de pasos seguidos experimentalmente durante el desarrollo
de esta práctica.
TABLA 1: Materiales, sustancias y equipos requeridos durante la práctica.
A continuación, se muestran los cálculos desglosados y los resultados obtenidos
experimentalmente.
Primera parte de la práctica
Cálculo de la cantidad de CN para elaboración del medio
Siguiendo la relación para la preparación de caldo nutritivo, entonces:
2
FIGURA 2: Diagrama de flujo del desarrollo experimental.
Establecer previamente un cultivo
de 24 h de B. thuringensis.
Pesar 0.504 g de CN
en la balanza
analítica.
Colocar el caldo en un matraz
volumétrico.
Aforar hasta obtener el
volumen necesario.
Trasvasar a 2 matraces
Erlermeyer.
Realizar 2 tapones de
algodón con gasas y 2
tapones de aluminio.
Esterilizar el cultivo en
autoclave a 121°C por 15
minutos.
Inocular el CN con un
cultivo puro de una cepa
nativa.
Incubar a 30°C
con agitación
constante.
Realizar diluciones seriadas.
Determinar la cantidad de células totales
utilizando conteo en cámara de Neubauer.
Obtener los radios R
y R2 de la centrífuga.
Determine el tiempo teórico de
operación de la centrífuga.
Pesar los tubos con la misma
cantidad de suspensión celular.
Centrifugar durante
el tiempo calculado.
Medir lo alto y ancho
del precipitado.
Comparar el volumen teórico con el
volumen que se obtuvo de células al
final del proceso de centrifugación.
2
Donde:
𝑉: volumen
𝐿: longitud = 4 𝜇𝑚
𝑑: diámetro = 1. 1 𝜇𝑚
Sustituyendo, tenemos:
2
3
𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑑𝑎 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎
Tomando en cuenta su volumen individual, podemos realizar una correlación con la masa,
teniendo la siguiente fórmula (Ec. 3):
3
] × 𝑑𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑛 𝑏𝑎𝑠𝑒 ℎú𝑚𝑒𝑑𝑎 [
− 3
3
6
Teniendo en cuenta el valor de densidad en base húmeda, obtenido de (Carrera et al., 2008),
sustituyendo entonces:
3
− 1
− 3
− 3
6
− 15
− 12
Tomando en cuenta el valor de la densidad de cada célula y su masa, podemos determinar
el volumen que debería de tener, con respecto al número de células calculado por el conteo
en cámara, entonces:
7
𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
3
7
3
− 12
3
3
− 5
3
7
𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
3
7
3
− 12
3
3
− 5
3
Ec. 2 : Cálculo del volumen de Bacillus thuringiensis
.
Ec. 3 : Cálculo de la masa de Bacillus thuringiensis.
.
Tercera parte de la práctica
Cálculo de tiempo teórico de operación de la centrífuga
Una vez obtenidos el radio del eje de giro (𝑟
1
) y la longitud del tubo (𝑟
2
) de la centrífuga,
investigado el valor del diámetro de la partícula (∅ 𝑝
), la viscosidad del medio continuo (𝜇),
la velocidad angular en radianes/s (𝜔) y la diferencia de las densidades entre la densidad de
la partícula (𝜌 𝑝
) y de la fase continua (𝜌
𝐿
), podemos aplicar la siguiente ecuación (Ec. 4):
Con los siguientes datos (Tabla 3),
Dato Valor
𝟏
𝟐
𝒑
𝝁 0. 00998 𝑔/𝑐𝑚 ∙ 𝑠, brindado en clase.
𝒑
3
(Carrera et al., 2008)
𝑳
3
, brindado en clase.
2 𝜋(𝑁[𝑟𝑝𝑚])
60
2 𝜋( 2500 )
60
𝑇
2
𝑝
2
2
1
Sustituyendo, tenemos:
𝑇
2
2
3
TABLA 3 : Recopilación de datos.
Ec. 4 : Cálculo del tiempo de centrifugación.
.
En la figura 3 se muestra nuestra evidencia de los tubos ya precipitados.
Una buena técnica de cultivo en medios líquidos es esencial para obtener resultados precisos
y confiables en la centrifugación de bacterias, y en cualquier otra técnica que se utilice para
estudiar microorganismos. La bacteria Bacillus thuringiensis es fácil de cultivar en medios
acuosos debido a su capacidad para crecer en ambientes con y sin oxígeno, y la disponibilidad
de medios sintéticos tales como el “CN” diseñados para proporcionar todos los nutrientes
necesarios para su crecimiento; aunque su proceso de esporulación es relativamente rápido,
causando posibles cambios en el conteo de Neubauer y en la torta dentro del tubo.
El cálculo del tiempo de centrifugación en un intervalo de 5min a 2500rpm permitió lograr
un sedimento estable, aunque con una cantidad menor a la esperada. EL cálculo de volúmenes
entre el medio de cultivo de 4BT y 5BT cumplieron con el objetivo de centrifugar una
concentración de bacterias del medio donde se encontraban.
FIGURA 3 : Sedimentos por fuerzas centrífugas de Bacillus Thuringiencis, muestras de 4BT y 5BT.
Evaluation of Food. Academic Press, New York.
Neubauer Chamber Cell Counting, 1–6.Slamti L, Perchat S, Huillet E, Lereclus D
(2014) Quorum sensing in Bacillus thuringiensis is required for completion of a full
infectious cycle in the insect. Toxins (Basel) 6:2239–2255. doi:
10.3390/toxins
Difference between the spore sizes of Bacillus anthracis and other Bacillus species.
Journal of Applied Microbiology, 102 (2), 303–312. https://doi.org/10.1111/j.1365-
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Bioquímica. Experimentación y Simulación”, 1ª ed. Editorial Síntesis (Madrid,
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rendimiento de producción y purificación de las proteínas Cry en Bacillus
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https://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/bitstream/1007/622/1/235011.pdf
Editorial UNISON. Hermosillo, Sonora. México. ISBN 968- 6569 - 83 - 9
