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PRACTICA DE MICROBIOLOGIA, Guías, Proyectos, Investigaciones de Microbiología

Universidad Bicentenaria de Aragua (UBA) - TurmeroMicrobiología

PRACTICA LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

Tipo: Guías, Proyectos, Investigaciones

2019/2020

Subido el 01/12/2020

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UNIVERSIDAD DE SONORA
DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD
PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA
LICENCIATURA EN ODONTOLOGÍA
MARÍA DEL SOL ALFARO SOTO
Práctica No. 2:
Métodos para Obtener Evidencia Directa de microorganismos.
31 de Agosto del 2020
Observación directa. Observación por medio de tinción (coloraciones). Tinción al Gram. Cápsula.
Esporas. El alumno aplicará diferentes métodos de observación microscópica para diferenciar
formas y estructuras de microorganismos y evidenciar su presencia.
Introducción
El examen directo de microorganismos vivos puede tener gran utilidad para determinar relaciones
de tamaño, forma y movilidad. Hay dos métodos generales que se utilizan para estudios de esta
naturaleza: las técnicas de gota suspendida y la preparación en fresco. Ambos métodos preservan
la forma natural de los microorganismos y reducen los efectos de distorsión que suelen ocurrir
cuando los especímenes se secan y fijan. Puesto que la mayoría de los microorganismos no son
muy diferentes en lo que respecta a color o índice de refracción con relación al fluido en el que se
suspenden, se aconseja usar una fuente de luz de menos intensidad para fines de observación.
Muestra: Orina (del día anterior sin refrigerar)
Material:
1 porta objeto excavado.
3 Portaobjetos normales y 2 cubreobjetos
1 asa redonda
1 mechero
Observación directa: Preparaciones húmedas.
Procedimiento de montaje en húmedo.
1. Homogenice la muestra de orina y con ayuda de una pipeta pasteur o asa de inoculación con
punta redonda transfiera una gota de caldo a un Portaobjetos.
2. Cubra cuidadosamente la gota con un cubreobjeto (limpio y seco) tomándolo de los lados para
no dejar impresos sus dedos sobre él.
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UNIVERSIDAD DE SONORA

DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA

LICENCIATURA EN ODONTOLOGÍA

MARÍA DEL SOL ALFARO SOTO

Práctica No. 2: Métodos para Obtener Evidencia Directa de microorganismos. 31 de Agosto del 2020 Observación directa. Observación por medio de tinción (coloraciones). Tinción al Gram. Cápsula. Esporas. El alumno aplicará diferentes métodos de observación microscópica para diferenciar formas y estructuras de microorganismos y evidenciar su presencia. Introducción El examen directo de microorganismos vivos puede tener gran utilidad para determinar relaciones de tamaño, forma y movilidad. Hay dos métodos generales que se utilizan para estudios de esta naturaleza: las técnicas de gota suspendida y la preparación en fresco. Ambos métodos preservan la forma natural de los microorganismos y reducen los efectos de distorsión que suelen ocurrir cuando los especímenes se secan y fijan. Puesto que la mayoría de los microorganismos no son muy diferentes en lo que respecta a color o índice de refracción con relación al fluido en el que se suspenden, se aconseja usar una fuente de luz de menos intensidad para fines de observación. Muestra: Orina (del día anterior sin refrigerar) Material: 1 porta objeto excavado. 3 Portaobjetos normales y 2 cubreobjetos 1 asa redonda 1 mechero Observación directa: Preparaciones húmedas. Procedimiento de montaje en húmedo.

  1. Homogenice la muestra de orina y con ayuda de una pipeta pasteur o asa de inoculación con punta redonda transfiera una gota de caldo a un Portaobjetos.
  2. Cubra cuidadosamente la gota con un cubreobjeto (limpio y seco) tomándolo de los lados para no dejar impresos sus dedos sobre él.
  1. Presione ligeramente el cubreobjeto, teniendo cuidado de no romper o dañar la preparación.
  2. Coloque la preparación en el microscopio y observe con el objetivo débil. Ajuste la apertura del diafragma para que entre una pequeña cantidad de luz.
  3. Examine ahora con el seco-fuerte aumentando la cantidad de luz y enfocando cuidadosamente con este aumento las bacterias se observarán más claramente.
  4. Examine con el objetivo de inmersión, utilizando para ello una gota de aceite de inmersión, para observar más de cerca los microorganismos, y de ser posible a los que exhiben movilidad. Anote sus observaciones entre formas y tamaños de los microorganismos observados. Procedimiento de gota pendiente:
  5. Tome un porta objeto excavado. (o prepare uno con Maskin tape)
  6. Ponga un poco de vaselina en la palma de su mano formando un círculo de aproximadamente 2.5cm de diámetro. (si utiliza el Portaobjetos excavado)
  7. Tome un cubreobjeto por sus orillas y páselo sobre la vaselina cuidadosamente para formar un anillo de vaselina en las orillas, procuran depositar la vaselina sobre el mismo lado del cubreobjeto.
  8. Ponga el cubreobjeto con la vaselina hacia arriba. (Ponga una gota de muestra en el cubreobjeto.
  9. Ponga un Portaobjetos excavado sobre la gota e inmediatamente después inviértalo para que la gota quede suspendida.
  10. Examine la preparación con el objetivo seco débil, localizando la orilla de la gota y moviendo el cubreobjeto hasta que la orilla del cubreobjeto cruce el centro del campo.
  11. Reduzca la intensidad de la luz con el diafragma y enfoque. Observe las diferentes formas, tamaño y tipo de movimiento.
  12. Cambie el objetivo seco-fuerte, y registre sus observaciones, al observar con aceite de inmersión. Responda las siguientes preguntas:
  13. ¿Tiene algún valor práctico la técnica de la gota suspendida? Dar una explicación. Mediante esta técnica se evitan las corrientes, que las preparaciones se sequen pronto. La gota presenta además multitud de planos de enfoque, con lo cual resulta más fácil la observación.
  14. Explicar las diferencias entre los movimientos verdadero y Browniano. El movimiento Browniano es aquel que se da de forma aleatoria en las partículas por medio de fluido o gas, esto por el efecto de choque que tienen entre sí.

TINCIÓN GRAM.

Introducción: La tinción Gram fue desarrollada en 1884 por el bacteriólogo Danés Hans Christian Gram. Es uno de los procedimientos de tinciones más usada porque divide a las bacterias en dos grandes grupos, Gram positivas y Gram negativas. El método Gram es una de las técnicas de tinción más importantes en la microbiología médica, pero ésta resulta inaplicable universalmente ya que algunas células bacterianas se tiñen pobremente o no se tiñen. Es más consistente cuando es usada en bacterias jóvenes o en desarrollo (cultivos nuevos). En muchos de los casos, la reacción que la bacteria provee con esta tinción nos da información importante para el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo: Las bacterias Gram positivas pueden ser destruidas fácilmente por la penicilina y sulfamidas. Las bacterias Gram negativas son resistentes a estos antibióticos, pero ellas son mucho más susceptibles a estreptomicina, cloranfenicol y tetraciclina. Hasta ahora, la tinción Gram en la identificación de bacterias puede ayudar a determinar cual antibiótico puede ser más efectivo contra las enfermedades. Tinción Gram. Procedimiento:

  1. Preparar 4 frotis y dejar que se sequen al aire y fijarlo a la flama.
  2. Cubrir las preparaciones (no el portaobjeto) con una solución de cristal violeta y dejar actuar el colorante durante 1 minuto. Figura:
  3. Lave con agua de la llave y retire una preparación para observar al microscopio. Cubra con Lugol los tres frotis siguientes y deje actuar por 1 minuto. Figura: 4.
  4. Escurra el Lugol, lave con agua corriente, retire otro frotis. Decolore los dos frotis restantes con alcohol al 95% o con alcohol-acetona. La decoloración suele verificarse en el término de segundos. Se conoce que es completa cuando el colorante no sale teñido con el cristal violeta; conviene que esta operación sea rápida para evitar una decoloración excesiva.
  5. Lavar con agua de la llave y retire otro frotis para observación.
  6. Cubrir el último frotis con safranina por 1 minuto.
  7. Lavar con agua, secar la preparación al aire o suavemente en kleenex y examinar con el objetivo seco débil hasta el de inmersión los cuatro frotis y realizar comparaciones. Figura:5. Se observarán las Bacterias Gram Positivas teñidas en violeta obscuro y las bacterias gram negativas en rojo Responda las siguientes preguntas:
  1. Porque es conveniente realizar una capa fina al momento de hacer el frotis del microorganismo a estudio. Para poder obtener una visión más centrada en el objetivo para obtener una forma clara y nítida de la muestra
  2. Cual es la ventaja que ofrece la observación con aceite de inmersión, con respecto a los objetivos secos. Que diferencia hay entre ellos. Porque brinda la propiedad de concentrar la luz cuando esta pasa a través del objetivo del microscopio y así aumentando su la resolución para tener una mejor vista.
  3. Como se diferencia el montaje fijo con respecto al húmedo, y que ventajas presenta el montaje fijo. Las células de montaje húmedo se utilizan se utiliza para investigaciones rápidas que no se requiera un registro permanente, así como para examinar líquidos fisiológicos. Las ventajas del montaje fijo las células son visibles más claramente después de teñidas. Además que observan las diferencias entre células de especies diferentes y dentro de la misma especie se demuestran mediante soluciones colorantes apropiadas
  4. Explique el mecanismo de la coloración Gram. Según la distribución del peptidoglicano de la pared celular que las envuelve, se tiñen de una forma u otra. Así, las bacterias que no se tiñen mediante esta técnica se denominan Gram negativas. Están formadas por una pared más fina formada por menos capas de peptidoglicano y una segunda membrana rica en lípidos (que repele la tinción Gram), al microscopio aparecen incoloras. Las Gram positivas tienen una pared celular mucho más gruesa, formada por un gran número de capas de peptidoglicanos entre las que se inserta la tinción Gram, dando un color violeta intenso al microscopio y se clasifican como Gram +. La gran aportación práctica de la tinción de Gram es que permite determinar el tipo de antibiótico así como su eficacia. El antibiótico de elección ha de ser capaz de atravesar la pared bacteriana, en función de si la bacteriana es gram positiva o negativa se seleccionará el antibiótico más eficaz.
  5. ¿Qué importancia médica tiene la tinción Gram? En la medicina ayudan a identificar las bacterias y así determinar el nivel de efectividad de los antibióticos en distintas enfermedades. Por ejemplo las bacterias Gram + pueden ser destruidas fácilmente por la penicilina y sulfamidas. Las bacterias Gram. son resistentes a estos antibióticos, pero ellas son mucho más susceptibles a estreptomicina, cloranfenicol y tetraciclina. Preparación de frotis:

integridad estructural. La función de la cápsula es la de protección y almacén de alimento, aumenta la capacidad infecciosa de bacterias patógenas. Cápsula. Procedimiento:

  1. Colocar una gota de cultivo en uno de los extremos de un Portaobjetos limpio.
  2. Colocar una gota de solución de nigrosina (tinta china) adyacente a la gota de cultivo.
  3. Colocar el portaobjeto sobre la mesa para afianzar el portaobjeto. Usar un segundo portaobjeto para deslizar y distribuir la nigrosina y el cultivo.
  4. Secar el frotis al aire.
  5. Observar bajo el objetivo de aceite de inmersión y contrarrestar su observación con una tinción gram y reportar. Responda las siguientes preguntas:
  6. Que es una tinción negativa. Es una técnica que permite contrastar las muestras mediante una sustancia opaca a los fotones (microscopía óptica) o a los electrones (microscopía electrónica). Este método de tinción utiliza colorantes neutros o ácidos ya que tienen poca afinidad por la célula bacteriana.
  7. Porque las bacterias capsuladas son más virulentas que las no capsuladas. Porque las cepas capsuladas son capaces de eludir la acción fagocitaria en ausencia de anticuerpos específicos.
  8. Mencione algunos ejemplos de bacterias encapsuladas y si causan alguna enfermedad. S. pyogenes: causa la faringitis estreptocócica, impétigo, celulitis y fascitis necrotizante. S. aureus: causa ampollas, meningitis (infección de las membranas que cubren el cerebro y la médula espinal), neumonía, infecciones del tracto urinario, mastitis (inflamación de los senos) y el síndrome de choque tóxico e infecciones intrahospitalarias cuando entran en heridas de pacientes postoperatorios. H. influenzae: en niños pequeños puede causar meningitis aguda, algunas infecciones de oído y de las vías respiratorias y casos de sinusitis.

Determinación de Esporas. Introducción: Las esporas bacterianas son tan bien conocidas por su resistencia a las altas temperaturas, la radiación, la desecación y la desinfección química, que casi siempre existe la tentación de considerar a la esporulación como un factor vital en la perpetuación de las bacterias. Si las bacterias que forman esporas fuesen las únicas formas microbianas existentes, este enunciado sería correcto; es más, durante muchos años se creyó que la esporulación se efectuaba cuando la célula se “enfermaba” a una situación de producir esporas o morir, amenaza que se presentaba por la inanición o por un ambiente tóxico. Aunque las bacterias forman esporas en algunas condiciones todavía desconocidas, no obstante, dichas esporas contribuyen a la supervivencia de los microorganismos que las producen. En esta práctica se demostrará la técnica de Schaeffer- Fulton para la diferenciación de esporas y células vegetativas. De acuerdo con este método, se aplica un colorante primario en solución acuosa al espécimen y se le hace vaporizar para incrementar la penetración de los recubrimientos relativamente impermeables de las esporas. Las esporas sometidas correctamente al método resistirán la situación por el colorante de contraste y a menudo se podrían observar esporas verdes dentro de células rojas. En esta forma se puede determinar la ubicación intracelular de las esporas de ciertos organismos y usarse también para fines taxonómicos. Esporas. Tinción de schaeffer-fulton. Procedimiento

  1. Preparar frotis de los cultivos proporcionados.
  2. Cubrir el frotis con verde de malaquita.
  3. Calentar hasta producir vapores durante 5 min.
  4. Deje que la preparación se enfríe durante otros cinco minutos.
  5. Enjuague con cuidado bajo una corriente suave de agua.
  6. Agregar safranina durante 1 minuto, para contrastar.
  7. Lave con cuidado, como se hizo en el paso5; secar con presión leve y observar mediante el objetivo de inmersión en aceite. Responda las siguientes preguntas:
  8. Hacer una lista de varios patógenos aerobios y anaerobios que forman esporas, así como de las enfermedades que causan.

Conclusión: Es necesario conocer los distintos tipos de métodos para obtener y observar evidencia que sea directa y clara de los microorganismos para poder conocerlos y estudiarlos con mayor exactitud, esto con el propósito de poder saber en que momento debemos utilizar cierto método, el procedimiento que debemos seguir y las reglas a tomar dependiendo del fin que se busque, así como conocer las mejores opciones para hacerlo de manera correcta. Bibliografía: https://www.lifeder.com/esporas-bacterianas/ https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx? bookid=1507&sectionid=102891618#:~:text=INTRODUCCI%C3%93N,-%2B%2B&text=Los %20bacilos%20grampositivos%20formadores%20de,especies%20de%20Clostridium%20son %20anaerobias. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S