Práctica
Detección de amilasa por halo de degradación en agar con almidón
I.- Fundamento
La amilasa hidroliza el almidón. El almidón sin degradar forma un complejo azul
con yodo (Lugol). Donde el almidón fue degradado, no hay color → aparece un
halo claro alrededor del pozo o punto de aplicación.
II.- Objetivo
Extraer un crudo enzimático de pan rallado y evidenciar actividad amilasa por la
formación de halos de aclaramiento en placas de agar con almidón tras la tinción
con yodo.
III.- Materiales y reactivos
• Pan rallado fresco (sin saborizantes).
• Buffer fosfato 50 mM o 0.05 M, pH 6.5
Preparación:
4.73 g de Na₂HPO₄·2H₂O fosfato disódico dihidratado (básico).
y
3.12 g de NaH₂PO₄·H₂O fosfato monobásico de sodio (ácido).
completado con agua destilada a 1 L.
• Agar con almidón
Preparación:
➢ Almidón soluble (de papa o maíz): 10 g
➢ Peptona: 5 g
➢ NaCl: 5 g
➢ Agar: 15 g
➢ Agua destilada: 1 litro
➢ Ajustar pH a 7.0 ± 0.2
➢ Esterilizar 121 °C, 15 min
• Solución de yodo (Lugol): 1% I₂ + 2% KI en agua destilada.
➢ 1 g de yodo sólido (I₂)
➢ 2 g de yoduro de potasio (KI)
➢ Agua destilada: completar hasta 100 mL
Preparación:
➢ Disolver el KI en 20–30 mL de agua destilada (ayuda a solubilizar el
yodo).
➢ Agregar el yodo poco a poco mientras se agita; observarás que se
disuelve lentamente y la solución se vuelve marrón oscura.
➢ Completar con agua destilada hasta 100 mL.
