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PRÁCTICA VII: PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES
Disoluciones tampón. Diluciones. Medidas de Absorbancia
1. DISOLUCIONES Y DILUCIONES: CONCEPTOS.
Una disolución o solución es una mezcla homogénea de una sustancia llamada soluto en un líquido llamado disolvente. Por tanto, disolver (no confundir con diluir) es el acto de mezclar homogéneamente un soluto en el seno de un disolvente líquido. El soluto, que puede ser un sólido, un líquido o un gas, una vez disuelto, será indistinguible a simple vista del disolvente. Por tanto, la disolución será un líquido homogéneo que se caracterizará por la concentración del soluto; es decir, por la masa de soluto disuelta por unidad de volumen de disolución. Conviene reparar en que el líquido llamado disolvente puede ser una sustancia pura (ejemplo, agua destilada, alcohol etílico, etc.) o bien puede ser, a su vez, una disolución de otro soluto (ejemplo, tampón fosfato potásico 0,1 M pH=7.3)
Cuando se trabaja con disoluciones suele ser frecuente tener que disminuir su
concentración a base de añadirles disolvente. A esta operación se le llama dilución , de manera que diluir (no confundir con disolver) es disminuir la concentración de una disolución. Puesto que diluir supone añadir disolvente a una disolución, el volumen final de ésta aumentará, pero sin modificar la cantidad de soluto disuelto, por lo que, necesariamente, la concentración de la solución final (C 2 ) será menor que la concentración inicial (C 1 ); o en otros términos, la disolución final estará diluida respecto a la inicial.
C 1 = soluto / V 1 C 2 = soluto / V 2
Ej.: En 1 litro ( V 1 ) de una solución a 20 g / L ( C 1 ), habrá 20 g de soluto. Si le añadimos 1 litro más de disolvente, la solución final tendrá 20g / (1 litro + 1 litro) = 20g / 2 L =10g / L = C (^2). En este ejemplo la dilución efectuada ha sido 1:2 (ó 1/2) (1 litro de disolución se ha llevado a 2 litros), resultando una concentración final C 2 = (1/2)×C 1. Se dice entonces que la disolución inicial se ha diluido 2 veces (factor de dilución, 1:2), que es equivalente a decir que su concentración ha disminuido a la mitad. Generalizando, tras un proceso de dilución 1:x, la concentración de la disolución de partida habrá disminuido x veces. De ahí que alcanzar un factor de dilución de 1:x se suela expresar también como diluir x veces. Ojo! No confundir el número de veces de dilución (2 en el ejemplo numérico anterior) con el número de pasos de dilución (sólo 1 en el ejemplo anterior). Así, si nos dicen que una disolución se diluyó en un primer paso 2 veces (i.e., 1 ml de disolución + 1 ml de disolvente; es decir factor de dilución 1:2), y en un segundo paso se diluyó 5 veces (i.e., 1 ml de la dilución anterior + 4 ml de disolvente; factor de dilución en este segundo paso 1:5), podremos afirmar que la dilución total tras los dos pasos fue de 10 veces (1:2 × 1:5 = 1:10)
La concentración de una disolución se puede calcular a partir de medidas espectrofotométricas siempre que el soluto tenga propiedades cromóforas; esto es, si absorbe radiación electromagnética de la zona del UV-VIS. Para ello se acude a la la ley de Lambert-Beer:
Dilución 1:
Aλ = ελ c l
Donde: Aλ = absorbancia a una longitud de onda, λ, característica (medida experimental) c = concentración del soluto l = paso óptico (distancia recorrida por la luz a través de la disolución)
ελ = coeficiente de extinción (constante característica de cada
cromóforo a la λ de medida).
La absorbancia no posee unidades. Si la concentración se da en unidades molares y el paso óptico en cm, entonces nos referimos al coeficiente de extinción molar , cuyas unidades son M-^1 cm-^1.
La absorbancia de una muestra la podemos determinar experimentalmente empleando un espectrofotómetro, o un colorímetro cuando se trata de medir a longitudes de onda en el rango del visible, como vamos a hacer en esta práctica.
Con carácter general, los valores de absorbancia que se pueden medir de manera fiable en el espectrofotómetro han de estar comprendidos en el intervalo 0,05 ≤Aλ≤ 1,00.
Ello es así porque, por definición, Aλ = log (Io/I); es decir, que la absorbancia depende
logarítmicamente del cociente de las intensidades lumínicas incidente (Io) y transmitida
(I) por la muestra. En consecuencia, sólo se obtendrán buenas medidas experimentales
cuando la intensidad lumínica transmitida por la muestra varíe entre 0,9Io y 0,1Io, lo que
es equivalente a afirmar que el valor de la absorbancia se sitúe entre 0,05 y 1,00, respectivamente.
Para conseguir que las medidas experimentales de Aλ se encuentren dentro de ese rango (0,05 – 1,00) se requiere frecuentemente diluir la disolución problema. En esta práctica aprenderemos cómo diluir una disolución para disminuir su concentración de forma simple y cuantitativa. Para ello, vamos a trabajar con disoluciones cuyo soluto será una proteína: la hemoglobina. En general, las disoluciones de proteína han de estar tamponadas para asegurar un pH que preserve el estado proteico nativo. Por tanto, el disolvente habrá de ser un tampón o disolución amortiguadora del pH ( buffer en inglés). En nuestro caso, acudiremos al tampón fosfato 5 0 mM, pH=7,0.
Las proteínas tienen propiedades cromóforas, y así, absorben en el UV en dos regiones características : en torno a 200 nm por sus enlaces peptídicos, y en torno a 280 nm por las cadenas laterales de sus aminoácidos aromáticos. En condiciones normales, para la cuantificación espectrofotométrica de las disoluciones de proteínas se suele medir a 280 nm, ya que a 200 nm pueden absorber muchas otras sustancias, con la consiguiente interferencia en la medida experimental. Pero, aparte de lo anterior, algunas proteínas pueden absorber en la zona del visible (λ > 400 nm). Son las proteínas coloreadas o cromoproteínas, que deben su color a la presencia en su estructura de grupos prostéticos (de naturaleza química no aminoácida). Este es el caso del grupo hemo de la hemoglobina, responsable del característico color rojo de esta proteína. Por ello, en esta práctica emplearemos una λ de 555 nm para la cuantificación de las disoluciones de hemoglobina.
La concentración de una disolución se puede calcular a partir de medidas espectrofotométricas si se conoce el coeficiente de extinción del soluto a una determinada λ y se mide experimentalmente la absorbancia de la disolución a esa λ. Cuando no se conoce el coeficiente de extinción, lo que se suele hacer es una calibración, consistente en construir una recta patrón a partir de las medidas de
decir, se tomará un volumen dado de la disolución inicial de hemoglobina, y se añadirá el volumen necesario del diluyente.
2ml
Dil 1: 10
2. 3 .- Preparación de diluciones seriadas a partir de una disolución concentrada. Se denomina dilución seriada a un conjunto o serie de diluciones en la que cada una de ellas se prepara a partir de la anterior. Permite llegar, de forma sencilla y con poco consumo de disolvente, a una concentración varios órdenes de magnitud inferior a la inicial.
Ejemplo:
Si tomamos un volumen, V, de una disolución inicial de concentración C y le añadimos 9 volúmenes ( 9 V) de disolvente, tendremos una dilución 1: 10 de la disolución inicial. Es decir, la concentración tras este primer paso de dilución será de C/ 10. Si a continuación volvemos a tomar un volumen, V, pero ahora no de la disolución inicial sino de esta dilución 1: 10 , y le añadimos 9 volúmenes ( 9 V) de disolvente, alcanzaremos un factor de dilución de 1:100 (=1:10×1:10) respecto a la disolución inicial. Si hacemos lo mismo con esta última dilución, llegaremos en el tercer paso a un factor de dilución de 1 : 1000 respecto a la disolución inicial. En definitiva, con tres pasos de dilución habremos alcanzado un factor de dilución de 1:1000, habiendo empleado sólo 27 volúmenes (27V) de diluyente; a la vez que dispondremos de una serie de cuatro disoluciones: disolución inicial ó dilución 1:1, dilución 1:10, dilución 1:100 y dilución 1:1000.
Generalizando lo anterior, con n pasos de dilución podremos conseguir un factor de dilución 1:10n, utilizando sólo 9n volúmenes (9nV) de eluyente. Así, si queremos diluir un volumen (V) de 2 ml de una disolución de partida, de manera que se alcance un factor de dilución tan grande como 10^9 , nos bastaría con 9 pasos de dilución y un volumen de disolvente de 162 ml ( 18 ml en cada uno de los pasos). Comparad esto con lo que se requeriría si no acudiéramos a una dilución seriada, sino que llevásemos a cabo una dilución directa en un solo paso. En tal caso, el factor de dilución 1:10^9 se alcanzaría mezclando en ese único paso de dilución los 2 ml de la disolución inicial con
- 9 99.999.998 ml (!!!) de disolvente; es decir, prácticamente 2 millones de litros de
V ml
V ml V ml
1/2V 1/5V
1/10V
Dil 1:2 Dil 1:
V/
V/ 5
V/ 2
disolvente, lo que aproximadamente equivale al volumen de una piscina olímpica. Impensable, ¿verdad?
C C/10 C/100 C/
En esta práctica se van a preparar de manera seriada^1 las diluciones que se muestran en el cuadro siguiente. La disolución inicial será hemoglobina a una concentración de 5 mg/ml. El agente diluyente será siempre tampón fosfato potásico 5 0 mM, pH 7.. Cada una de las diluciones se hará por duplicado , y cada tubo tendrá un volumen final de 4 ml al alcanzar la dilución correspondiente. Asegurad en todo momento la agitación suficiente de las mezclas para que se alcance la homogeneidad requerida. Como ya se ha comentado, las medidas de absorbancia se realizarán a 555 nm por ser esta longitud de onda un máximo característico del grupo hemo de la hemoglobina.
nº tubo Diluc. final Diluc. parcial Tampón (ml) Hb (ml) mg/ml A 555
1 /1’ 1 :1 1 :1^ ⎯ 4 5 2 /2’ 1 : 2 1 : 2 2 2 3 /3’ 1 : 5 4 /4’ 1 : 10 5 /5’ 1 : 20 6 /6’ 1 : 50 7 /7’ 1 : 100 8 /8’ Blanco 4 ⎯ 0 0 A / A’ Problema ⎯^ ⎯ ⎯ B / B’ Problema ⎯^ ⎯ ⎯
(^1) La preparación de diluciones de manera seriada implica que cada paso de dilución se llevará a cabo sobre la mezcla que haya resultado del paso de dilución inmediatamente anterior. Así, el tubo 2 se obtendrá diluyendo la disolución del tubo 1; el tubo 3 diluyendo la del tubo 2, el tubo 4 diluyendo la del tubo 3, y así sucesivamente.
1/10 1/10 (^) 1/
