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Práctica 1. Primera parte: Utilización
del microscopio óptico para la
observación de muestras biológicas
1 Introducción
El microscopio es una herramienta utilizada por la mayor parte de los biólogos. La razón es obvia: las células son las unidades básicas de la vida y su medida se encuentra, con algunas excepciones, fuera del límite de resolución del ojo humano (0,25 μm). Por ello es necesario utilizar instrumentos como el microscopio, que permiten visualizarlas. La función del microscopio es triple:
- producir una imagen aumentada de la muestra, 2) separar los detalles en la imagen y 3) hacer posible que estos detalles sean visibles.
El microscopio incluye un grupo de instrumentos que comprende no sólo los microscopios formados por múltiples lentes (microscopios compuestos) sino también instrumentos muy sencillos como la lupa. Una lupa típica consta de una sola lente biconvexa que produce una ampliación entre 1,5 y 30 veces, y tiene la ventaja de que permite la visión estereoscópica (en relieve) y la manipulación de la muestra durante la observación.
Para conseguir un mayor aumento de la imagen se utiliza el microscopio óptico compuesto, denominado así porque está formado por dos sistemas de lentes, el ocular y el objetivo. No vamos a realizar una descripción exhaustiva del microscopio, pero consideramos que el alumnado de esta asignatura tiene que conocer los principales componentes y los principios básicos de su funcionamiento para observar e interpretar correctamente las preparaciones.
1.1 Partes del microscopio
El microscopio óptico está formado por las siguientes partes (Figura 1.1):
1.1.1 El sistema mecánico
Está constituido por el conjunto de piezas encargadas de sujetar i desplazar el resto de componentes:
- Pie : es la base sobre la que descansa todo el aparato. Da soporte a todos los elementos del microscopio y permite mantenerlo en posición vertical.
- Brazo : Sostiene al resto de los componentes.
- Platina : es una placa metálica cuadrada o redonda sobre la que se coloca y sujeta, mediante una pinza, la preparación histológica. Ésta puede ser desplazada en sentido anteroposterior y lateralmente mediante dos tornillos que la mueven.
- Tornillos de enfoque : son los tornillos macrométrico y micrométrico. El segundo se utiliza para conseguir un enfoque preciso.
Figura 1.1 Microscopio visto de perfil y de frente
1.1.2 El sistema de iluminación
Está formado por las piezas del microscopio que dirigen la luz a la muestra para que la imagen pueda ser ampliada por el sistema óptico. En general, consta de les siguientes partes:
- Luz o fuente de iluminación, que se enciende mediante un interruptor.
- Botón regulador de la intensidad , que controla la luz que llegará a la muestra.
- Diafragma, que controla el diámetro del haz de luz.
- Portafiltros, en algunos microscopios. Permite la utilización de filtros de colores para resaltar las estructuras teñidas con un color determinado.
1.1.3 El sistema óptico
Es el encargado de aumentar la imagen de la muestra. Consta de las siguientes partes:
Tornillo macrométrico
Tornillo micromètrico
brazo
Condensador Diafragma
fuente de luz
oculares
revólver objetivos (^) pinza platina Mandos de la platina
pie
1.2 La formación de la imagen
Para entender el funcionamiento del sistema óptico es necesario conocer algunas cuestiones básicas sobre las lentes:
Una lente es un componente de vidrio o de plástico transparente, generalmente de diámetro circular, con dos superficies que pueden producir la convergencia (una concentración) o la divergencia (dispersión) de la luz. Las lentes convergentes forman imágenes reales e invertidas de los objetos, es decir, las imágenes se pueden recoger en una pantalla. Las lentes divergentes forman imágenes virtuales y directas, que sólo podemos ver a través del ojo (Figura 1.3).
El objetivo está formado por lentes convergentes y el ocular por lentes divergentes, por lo tanto, la imagen formada por el microscopio es una imagen virtual, invertida y ampliada de la muestra. Como el objetivo invierte la imagen en todos los sentidos (de derecha a izquierda y de arriba abajo) y el ocular no puede volver a invertirla, la observaremos completamente a la inversa. Conviene tenerlo en cuenta porque cuando movemos la preparación con los mandos de la platina para centrarla en la trayectoria de los rayos de la luz, la imagen se desplaza ante nuestros ojos en sentido contrario al que esperaríamos.
Por otra parte, el aumento total al cual observamos una muestra será el resultado de multiplicar los aumentos del objetivo por los aumentos del ocular.
Imatge final
O bjectiu (^) O cular B
A
B ’’ B ’
A’’
A’
F (^) ob F ’ob F^ oc F ’oc
Figura 1.3. Formación de la imagen. El objeto que estudiamos se sitúa ante el plano focal del objetivo, así se obtiene una primera imagen real, aumentada e invertida del objeto, que se denomina imagen primaria. El ocular forma la imagen final, virtual, más grande que la imagen primaria.
1.3 El poder de resolución
La característica que determina la calidad del microscopio óptico es el poder de resolución, es decir, la capacidad para distinguir como distintos y separados dos puntos muy próximos entre sí. Es, pues, la capacidad de reproducir detalles. El poder de resolución se calcula utilizando la inversa del límite de resolución (poder de resolución = 1/ límite de resolución).
El límite de resolución de un microscopio se define como la distancia mínima a partir de la cual ya no es posible distinguir la separación entre dos puntos. Este valor se calcula según la fórmula siguiente, donde LR es el límite de resolución:
LR = λ 0,61/ n sin θ
λ es la longitud de onda la de la luz: cuanto más pequeña es la longitud de onda de la luz utilizada, más pequeño será el límite de resolución y, por lo tanto, más grande el poder de resolución. n es el índice de refracción del medio, a través del cual la luz se dirige desde la preparación hasta el objetivo. Es el cambio en la velocidad de la luz difractada. θ es la mitad del ángulo del cono de luz que entra en la lente del objetivo. El valor óptimo de θ será el que coincida con el diámetro de la lente del objetivo (Figura 1.4). n sin θ es la apertura numérica , que representa la capacidad de la lente del objetivo para recoger rayos de luz (Figura 1.4). Cada objetivo tiene un valor determinado de apertura numérica que se indica por un número situado junto al número indicativo de los aumentos.
Figura 1.4. Diferencia de apertura numérica entre un objetivo seco y otro de inmersión.
Según esta fórmula, una de las principales limitaciones del microscopio óptico es, precisamente, la utilización de luz para la formación de la imagen, puesto que la radiación de una longitud de onda determinada no puede utilizarse para examinar detalles más pequeños que esta longitud de onda. Esto hace que el límite máximo de resolución del microscopio óptico esté entre 0,4 μm y 0, μm (es decir, la longitud de onda del espectro de la luz visible). Si queremos
θ^ θ
Aire Aceite de inmersión
Portaobjetos
Cubreobjetos
Objetivo
- Coloca la preparación sobre la platina y ajústala con las pinzas. Moviendo los mandos de desplazamiento de la platina debes conseguir que la muestra quede alineada con el haz de la luz.
- Si el condensador se puede desplazar, debe estar a unos 5 mm de la preparación cuando utilizamos objetivos de bajos aumentos, y más cerca (2 mm) si utilizamos los de mayor aumento. El condensador tiene un diafragma que permite regular la cantidad de luz que incidirá sobre la preparación. Debéis utilizarlo convenientemente.
- Para enfocar: con el macrométrico, y mirando directamente la preparación (no a través del ocular), acerca al máximo la preparación al objetivo. A continuación, mirando a través de los oculares, separa despacio el objetivo de la preparación con el macrométrico.
- Debes aprender a mirar por los dos oculares a la vez, de forma que consigáis ver un solo campo visual. Para ello, colocad los oculares a la distancia adecuada a vuestra distancia interocular. Cuando observéis la muestra, utilizad el micrométrico para hacer un enfoque fino de la preparación.
- Desplaza la preparación para centrar aquella parte que quieras ver a mayor aumento.
- Gira el revólver para colocar el objetivo siguiente. Si fuera necesario, debes ajustar la luz mediante el condensador y el diafragma.
- La imagen estará enfocada, pero si quieres hacer un enfoque más fino, sin tocar el macrométrico (hay peligro que la preparación se rompa), mueve un poco el micrométrico hasta que la preparación se vea nítida.
- Puedes volver a dar el paso anterior para observar la preparación con un objetivo de más aumentos. Si hay que utilizar un objetivo de 100x, tendréis que seguir esta metodología:
- Una vez elegida la zona de la preparación que quieres observar, baja la platina, sube el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que queremos visualizar y donde tenemos que poner el aceite de inmersión.
- Gira el revólver y déjalo entre el objetivo de 40x y el de 100x.
- Coloca una pequeña gota de aceite de inmersión sobre el círculo luminoso.
- Gira el revólver para colocar el objetivo de 100x.
- Mirando directamente el objetivo, sube la platina despacio hasta que la lente toque la gota de aceite.
- Enfoca con cuidado utilizando el tornillo micrométrico.
- Al terminar la observación, baja la platina, coloca el objetivo de menor aumento y limpia el objetivo de inmersión con mediante un papel especial para lentes.
- Una vez finalizada la observación, se coloca el objetivo de 4x, se aleja la platina del revólver, y se tapa con la funda.
5 Cuestiones
- ¿Cómo cambia la iluminación de la preparación cuando desplazamos el condensador? ¿Y cuando mueves el diafragma?
- Escribe e interpreta las inscripciones de cada uno de los objetivos.
- ¿Cuáles son las tres características de la imagen formada por el microscopio compuesto? Si con los mandos de desplazamiento de la platina desplazamos la muestra de derecha a izquierda, como se mueve la imagen?
- ¿Cómo se calcula el aumento total del microscopio?
- ¿Por qué debemos centrar la zona de la muestra que nos interesa si queremos observarla con objetivos de mayores aumentos?
- Calcula el límite de resolución de cada objetivo del microscopio aplicando la fórmula que corresponda y considerando la longitud de onda de 500nm, 600nm y 700 nm.
6 Bibliografía
- ALBERTS B., D. BRAY, J. LEWIS., M. RAFF, K. ROBERTS & J.D. WATSON. Biología Molecular de la Célula. 5ª Ed. 2010.
- COOPER, G.M. La Célula. 5ª edición. Marbán Libros, S.L., España. (2014).
- CURTIS, H. Y N.S. BARNES. Biología. 7ª edición española. Editorial Médica Panamericana. (2008).
- DE JUAN, J. Introducción a las técnicas instrumentales en Biología Celular , Universitat d’Alacant, 1998.
