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PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA
2º Curso Grado Biología
- CURSO 2012-
- OBJETIVOS ÍNDICE
- NORMAS DE SEGURIDAD
- CALIFICACIÓN............................................................................................................
- ORGANIZACIÓN.........................................................................................................
- MATERIAL POR PAREJA
- MEDIOS DE CULTIVO
- ESTERILIZACIÓN
- SIEMBRA DE MICROORGANISMOS
- FERMENTACIÓN DE AZUCARES
- OBSERVACIÓN DE LAS BACTERIAS.............................................................................
- ENSAYOS BIOQUÍMICOS ESTANDARIZADOS (API20E)
- ANTIBIOSIS
- ACTIVIDAD CATALASA
- ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUAS CONTAMINADAS
- TRANSFERENCIA GENÉTICA ENTRE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
- TITULACIÓN DE UN VIRUS BACTERIANO y TRANSDUCCIÓN
- CRECIMIENTO BACTERIANO
- AISLAMIENTO DE BACTERIAS LÁCTICAS Y PRODUCCIÓN DE YOGUR
OBJETIVOS
El objetivo de estas prácticas consiste en familiarizar al alumno con algunas de las técnicas más comúnmente utilizadas en los laboratorios de Microbiología y permitir la observación experimental de los conceptos aprendidos durante las clases de teoría.
NORMAS DE SEGURIDAD
Aunque los microorganismos que vamos a manejar no son patógenos habituales, su ingestión masiva o el contacto con heridas puede provocar diversos problemas. Por ello hay que seguir unas cuantas normas de seguridad:
- No se puede fumar, comer o beber en el laboratorio.
- Es obligatorio la utilización de la bata.
- La ropa y los objetos personales no deben mantenerse cerca de las zonas de trabajo.
- Al comenzar las prácticas conviene colocar un papel de filtro sobre la zona de manipulación, y retirarlo al terminar el día.
- Lavarse las manos cuidadosamente antes de salir del laboratorio.
CALIFICACIÓN
Cada alumno deberá completar un cuaderno donde anotará con detalle los fundamentos de la
práctica correspondiente, los resultados obtenidos, y la explicación de éstos.
ORGANIZACIÓN
Las prácticas se desarrollarán por parejas en dos periodos de una semana cada uno. El programa diario que se describe a continuación puede ser sujeto a modificaciones dependiendo del calendario concreto de cada grupo.
MEDIOS DE CULTIVO
Para empezar a trabajar en cualquier laboratorio de Microbiología se requiere disponer de una serie de medios de cultivo estériles. Aunque se darán ya preparados por falta de tiempo, resulta necesario conocer los métodos de preparación y esterilización utilizados habitualmente en el laboratorio.
Los medios de cultivo que vamos a utilizar son indefinidos o naturales, porque en su preparación siempre se incluye algún extracto de composición química desconocida. El más utilizado, el caldo común o su versión solidificada con agar, es un medio que permite el crecimiento de la mayoría de las bacterias que se van a utilizar en estas prácticas, pero también se emplean otros que contienen inhibidores semiespecíficos como el agar de McConkey, cuyas sales biliares inhiben el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram positivas. En algunos casos, se utilizarán medios que contienen componentes tales como indicadores de pH que cambian de color cuando el microorganismo realiza una actividad metabólica preferente sobre substratos concretos (Ej.: fermentación).
Preparación de medios de cultivo:
Caldo común. Composición por litro.
Extracto de carne 3 g Peptona bacteriológica 10 g Cloruro sódico 5 g (para estas prácticas, añadir Magnesio)
Para prepararlo, se añaden los distintos componentes en un matraz de dos litros, se disuelven en agua, se ajusta el pH a 7.2-7.4 (en nuestro caso no es necesario porque el pH queda ajustado directamente) y se lleva al volumen final correspondiente. Posteriormente, se reparten, utilizando una jeringa hasta acabar con todo el volumen, 5 ml/tubo. El resto del medio se reparte en matraces con 50 y 75 ml. Los recipientes se aíslan con tapones metálicos o de algodón graso envuelto en gasa y se esterilizan a 1 atm de sobrepresión durante 20 minutos.
Agar nutritivo. La composición es la misma que la del caldo común, pero se añade antes de esterilizar 15 g de agar por litro, disolviéndolo durante la esterilización. Cuando aún está caliente, se agita para hacer la disolución de agar homogénea y se extiende en placas (a 45ºC).
Medio base para la fermentación de azúcares. Inicialmente se prepara un medio base pobre en aminoácidos de la siguiente composición por litro:
Extracto de carne 1 g Peptona bacteriológica 10 g Cloruro sódico 5 g
Una vez disueltos los componentes, se ajusta el pH a 7 y se añaden 2 ml de solución de púrpura de bromocresol (PBC: 1.6 g en 100 ml de etanol al 45%. Se disuelve inicialmente en etanol al 95 y posteriormente se diluye con agua) por litro. Este es un indicador de pH que vira a amarillo por debajo de pH 5.2, por lo que permite la detección de la producción de ácido en el medio. El medio se reparte en tres volúmenes iguales a los que se añade 10 g por litro de glucosa, lactosa (Gal-Glu) o sacarosa (Glu-Fru). Una vez disuelto, se reparten, utilizando una jeringa hasta acabar con todo el volumen, 7
ml/tubo, en el que previamente se ha introducido una campana Durham, pequeño tubo de ensayo que se dispone en posición invertida para detectar la presencia de gases. El medio ha de ocupar completamente el interior de estas campanas para poder detectar posteriormente el desprendimiento de gases en la fermentación. (No olvidar marcar cada tubo con la inicial del azúcar que contenga: G, L o S). Una vez taponados, se esterilizan a 0.5 atm de sobrepresión durante 20 min.
El resto de los medios utilizados ya vienen premezclados en forma deshidratada y listos para su reconstitución. Las principales características a destacar de su composición son:
Agar de MacConkey. Contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro) que vira hacia rojo a pH ácido cuando la lactosa es fermentada. Además, contiene sales biliares que inhiben el crecimiento de muchas bacterias, especialmente Gram positivas.
Agar al verde brillante (AVB). Contiene lactosa, sacarosa, una elevada concentración de aminoácidos, verde brillante como inhibidor de crecimiento de muchos fermentadores, y rojo de fenol como indicador de pH. Los oxidativos producen amonio a partir de los aminoácidos y generan color rosa. Los fermentativos o no crecen o dan color amarillo.
Agar de tres azúcares e hierro (TSI). Contiene lactosa, sacarosa y glucosa, citrato férrico y tiosulfato de sodio, elevada concentración de aminoácidos y rojo fenol como indicador. Se prepara en tubos inclinados pero de mucho volumen. Las bacterias se inoculan en picadura (microaerobiosis) y extensión superficial. Las fermentadoras generan color amarillo por acidificación y las oxidativas rosa sobre la superficie (basificación). Las sulfitoreductoras dan sulfuro de hierro que resulta en precipitados negros en la zona anaeróbica.
Agar Eosina-Azul de Metileno (EMB). Se trata de un medio rico lactosado con dos colorantes, eosina y azul de metileno, que también funcionan como inhibidores del crecimiento de Gram positivos. En este medio E.coli crece como colonias negras con brillo verde metálico.
Caldo de urea-Indol. Es un medio muy pobre y bastante tamponado que permite determinar la presencia de la actividad ureasa y la producción de indol a partir de triptófano. En estas prácticas se empleará solamente para determinar la presencia de actividad ureasa, cuya actividad provoca la degradación de la urea presente en el medio (un 2% p/v) a CO2 y Amonio, con la consiguiente alcalinización. Este cambio de pH es detectado por cambio de color del indicador azul de bromotimol desde el verde original al azul intenso. Si se quisiera determinar la producción de indol bastaría añadir al medio tras la incubación 0.3 ml el reactivo de Kovacs (reactivo IND del ensayo API), siendo positiva si se produce cambio de color al rojo.
Agar MRS (Man, Rogosa y Sharpe). Se trata de un medio natural muy rico que contiene polisorbato, acetato, magnesio y manganeso que actúan como factores de crecimiento para muchos lactobacilos. El crecimiento se efectuará en medios microaerófilos empleando jarras para el cultivo de organismos anaeróbicos y un sistema comercial para la eliminación del oxígeno.
Como instrumento portainóculos más frecuente se utiliza el asa de siembra, con el que se puede tomar inóculo a partir de colonias o de medio líquido, debido a que mantiene un pequeño volumen de agua por tensión superficial. Para depositar el inóculo en líquido basta con introducir el extremo en el medio y agitar ligeramente. Sobre sólido hay que hacer un recorrido largo sobre la superficie salvo en el caso del medio TSI, en el que también hay que inocular picando en profundidad para observar reacciones metabólicas en anaerobiosis. A veces se utilizan pipetas para transportar volúmenes grandes de inóculos como en la práctica de crecimiento bacteriano.
Procedimiento: Cada pareja deberá inocular y mantener durante la mayor parte de las prácticas una serie de bacterias conocidas que denominaremos colección y una bacteria sin nombre que constituirá el problema y que deberá de ser identificado después de realizar toda una serie de ensayos. Las bacterias de la colección y sus temperaturas de crecimiento son:
Escherichia coli 37ºC Gram negativa Pseudomonas aeruginosa 37ºC Gram negativa Staphylococcus aureus 37ºC Gram positiva Micrococcus luteus 30ºC Gram positiva Nocardia corallina 30ºC Gram positiva Bacillus cereus 37ºC Gram positiva (¡Forma esporas! Utilizar en último lugar)
En esta práctica se inocularán cada una de las bacterias de la colección en un tubo de caldo común y en otro de agar inclinado. La bacteria problema, además de en estos medios, será inoculada en una placa de agar común al objeto de obtener colonias aisladas, bien por agotamiento de la siembra o bien por siembra y esterilización entre recorridos solapantes, según las explicaciones de los monitores. Una vez inoculado, incubar cada bacteria a su temperatura óptima de crecimiento y no olvidarse de marcar el nombre de la bacteria y la clave de pareja de prácticas.
FERMENTACIÓN DE AZUCARES
Se entiende por fermentación a reacciones de mantenimiento que no requieren la participación de una cadena de transporte de electrones, aunque en ciertos casos éstas pueden jugar papeles auxiliares. En el caso de azúcares se trata de procesos de óxido-reducción capaces de regenerar NAD y que comúnmente tienen como productos finales alcoholes (etanol, isopropanol, n-butanol, etc.), ácidos (acético, fórmico, láctico, etc.) acompañados o no por la formación de gases.
Además de su interés bioquímico, la capacidad para fermentar diferentes azúcares es una propiedad utilizada muy frecuentemente en taxonomía. En nuestro caso utilizaremos un procedimiento clásico para ensayar la capacidad de fermentación de tres azúcares: Glucosa, Sacarosa y Lactosa. La producción de ácidos se observará por el viraje a amarillo del Púrpura de Bromocresol. La producción de gas por su acumulación en las Campanas Durham, de donde habrá desplazado parte del líquido inicialmente incluido. Ambas determinaciones se efectuarán a las 24 y 48 horas de incubación para así tener una idea de la rapidez de su producción. Asimismo, se hará una cuantificación en función de la extensión del viraje del indicador y de la cantidad de gas producida.
Procedimiento:
Inocular con la bacteria problema y con una de la colección (escogidas de forma que no estén repetidas en la mesa) e inocular cada una de ellas en cada uno de los tres azúcares (G,S,L). Incubarlos a
las correspondientes temperaturas de crecimiento. Hacer las determinaciones a las 24 y 48 horas y apuntar los datos del problema y de toda la colección en el cuaderno de prácticas.
OBSERVACIÓN DE LAS BACTERIAS
a) Observación macroscópica.
El tamaño de las bacterias impide verlas a simple vista. Sin embargo, las colonias que forman sobre medios sólidos sí son visibles, y en ellas se puede estudiar una serie de características que nos ayudan a su identificación. A nivel morfológico, podemos estudiar la forma de las colonias, su tamaño, aspecto del borde (liso, rugoso, ondulado, ramificado, etc.), presencia de brillo, color, etc. Incluso sobre medio líquido las bacterias producen modificaciones de interés para su clasificación y que tienen que ver esencialmente con las características de su metabolismo. Así se observa si la turbidez es uniforme, si crecen en el fondo, si lo hacen en la zona superficial, si producen pigmentos, etc.
b) Observación microscópica.
Puesto que la inmensa mayoría de las bacterias son incoloras, la única forma de observarlas bien en el microscopio óptico consiste en incrementar su contraste con respecto al medio. Esto se consigue mediante su teñido con colorantes o mediante la disposición de una óptica especial de contraste, generalmente de fases, en el microscopio.
La disponibilidad de sistemas de contraste de fases permite observar a las bacterias vivas y determinar algunas características tales como su movimiento. Para ello, disponer una gota de cultivo líquido, previamente agitado, sobre un portaobjetos y taparlo con un cubre de forma que se establezca una delgada película entre ambos cristales. Posteriormente, se observa con el objetivo de contraste de 40x (ojo!, tiene una banda roja y no todos los microscopios disponen de él) y el condensador anular (se desplaza horizontalmente y con suavidad hasta alcanzar su posición en el camino óptico). Con este sistema se deben de poder distinguir aquellas bacterias con flagelación polar, que se mueven en zig-zags muy rápidos, de la perítricas, de movimientos más suaves y ondulados. En las inmóviles se producen desplazamientos generales por la existencia de corrientes y vibraciones en el medio de observación. Determinar la forma y capacidad de movimiento de la bacteria problema, y observar también alguna preparación de las de la colección: Pseudomonas (polar), E.coli (perítrica), etc.
Para observar las bacterias teñidas, hay que proceder previamente a su fijación. Inicialmente se prepara un frotis a partir de medio líquido o dispersando en una gota de agua una porción de células crecidas en sólido. Posteriormente se deshidrata el frotis por calentamiento suave utilizando el reverso de la mano como control de temperatura tras pasar repetidamente el portaobjetos sobre la llama del mechero. Tras la fijación por calor se procede a la tinción.
Tinción de Gram. Se trata de una tinción diferencial muy utilizada que distingue las bacterias por las características de su pared celular. Con el fin de disponer de controles internos que nos permitan saber si la tinción ha sido correcta se efectúan tres tinciones como mínimo: una con la bacteria problema sola, y otras dos en las que ésta es mezclada (a nivel del frotis!) con una bacteria G+ o con una G- de morfología distinta a la problema. Así, si todo va como debe la bacteria problema ha de mantener su coloración Gram constante en los tres frotis, apareciendo en una de las mezclas otras bacterias de coloración Gram contraria. El proceso de tinción se efectúa siguiendo el siguiente protocolo:
ENSAYOS BIOQUÍMICOS ESTANDARIZADOS (API20E)
Además de las fermentaciones de azúcares, existe una gran diversidad de ensayos bioquímicos que permiten identificar a un determinado organismo. No obstante, el desarrollo individualizado de un conjunto de estos ensayos es muy lento, y requiere la manipulación de gran cantidad de material, lo que a efectos prácticos los hace inviables en laboratorios de análisis rutinarios. Para éstos, se han desarrollado sistemas miniaturizados que permiten el ensayo a gran escala y de forma sencilla de muchos ensayos bioquímicos simultáneos. Uno de estos ensayos es el denominado galería API20E, especialmente diseñados para Enterobacterias, pero que puede ser aplicado a otras bacterias. En nuestro caso, usaremos una galería de ensayo de este tipo para caracterizar algunas reacciones bioquímicas de la bacteria problema. Actividades a ensayar. La galería API20E consta de 10 reacciones específicas de fermentación para los azúcares y otras 10 reacciones de utilización de sustratos o presencia de determinadas enzimas según se detalla en el siguiente cuadro: TESTS SUBSTRATOS REACCIONES/ ENZIMAS
NEGATIVO POSITIVO
ONPG Orto-nitro-fenil- galactósido
β-galactosidasa incoloro amarillo (1)
ADH Arginina arginina dihidrolasa amarillo rojo/naranja (2) LDC Lisina lisina descarboxilasa amarillo naranja ODC Ornitina ornitina descarboxilasa amarillo rojo/naranja (2) (CIT) Citrato sódico utilización de citrato verde-pálido/ amarillo
azul-verde/ azul (3) H2S Tiosulfato sódico producción de sulfídrico incoloro/ gris depósito negro
URE Urea ureasa amarillo rojo/naranja TDA Triptófano triptófano deaminasa amarillo* marrón* IND Triptófano producción de indol amarillo* anillo rojizo* (VP) piruvato sódico producción de acetoína incoloro* rojo-rosa (GEL) gelatina de Kohn gelatinasa No difusión difusión de pigmento negro GLU Glucosa fermentación/Oxidación (4) Azul/verdoso Amarillo MAN Manitol fermentación/Oxidación (4) Azul/verdoso Amarillo INO Inositol fermentación/Oxidación (4) Azul/verdoso Amarillo SOR Sorbitol fermentación/Oxidación (4) Azul/verdoso Amarillo RHA Ramnosa fermentación/Oxidación (4) Azul/verdoso Amarillo SAC Sacarosa fermentación/Oxidación (4) Azul/verdoso Amarillo MEL Melibiosa fermentación/Oxidación (4) Azul/verdoso Amarillo AMY Amigdalina fermentación/Oxidación (4) Azul/verdoso Amarillo ARA Arabinosa fermentación/Oxidación (4) Azul/verdoso Amarillo *) Requiere la adición de reactivos
- Un amarillo muy pálido debe considerarse positivo
- Un color naranja pálido después de 24 horas de incubación podría considerarse negativo
- La lectura debe hacerse en la cúpula (aerobiosis)
- La fermentación comienza en la parte inferior de los tubos, la oxidación en la superior
Materiales y reactivos:
Galería de identificación API20E P-200 y puntas estériles
Pipetas de 5 ml estériles Tubo 5 ml estéril Solución salina estéril (Cloruro sódico 0.9%) Aceite de parafina estéril
Reactivo TDA Cloruro férrico 3.4 g Agua 100 ml Reactivo IND Paradimetil-amino-benzaldehido 5 g Alcohol isoamílico 75 ml HCl 37 % 25 ml Reactivo VP1 KOH 40 g Agua 100 ml Reactivo VP2 1 naftol 6 g Etanol 100 ml
Procedimiento:
Preparar una cámara de incubación con su tapa correspondiente. Anotar el número de pareja en el lateral de la galería y repartir 5 ml de agua en los alvéolos para proporcionar una atmósfera húmeda.
Colocar la galería en la cámara de incubación.
Disponer 5 ml de solución salina estéril en el tubo. Tomar mediante el asa de siembra una colonia aislada y homogeneizar la suspensión con el agitador.
Inoculación de la galería (ver el esquema)
- Llenar los tubos pero no las cúpulas (A) de los tests salvo los indicados abajo.
- Llenar el tubo y la cúpula (B) de los test (CIT), (VP) y (GEL) con la suspensión anterior.
- Llenar la cúpula de los test ADH, LDC, ODC, URE, H2S con aceite de parafina (C) para obtener atmósfera anaerobia.
- Cerrar la cámara de incubación e incubar a 35-37ºC durante 24 horas.
A B^ C
Lectura de la galería (Anotad todos los datos obtenidos en el cuaderno!):
Leer los resultados de las reacciones espontáneas de acuerdo con la tabla de positivos y negativos. Anotadlo en el cuaderno.
Revelado de (VP): Añadir 1 gota de reactivo VP1 y otra de VP2. Esperar 10 min. Si sale rojo o rosa es positivo.
pinzas esterilizadas por calentamiento y enfriadas al aire. Para extraer los discos de sus contenedores hay que seguir las instrucciones de los monitores.
Prueba cuantitativa. Se trata de determinar el grado de sensibilidad o concentración mínima inhibitoria (CMI) de un antibiótico frente a la bacteria ensayada. Cada pareja sembrará de la forma descrita un césped de E. coli, y colocará cinco discos con cantidades crecientes de Estreptomicina. Para preparar los discos, cada pareja preparará 5 diluciones seriadas (1:4 en agua estéril) a partir de una disolución valorada que le darán los monitores, y añadirán 10 μl de cada una de éstas diluciones a sendos discos de papel estériles. Puesto que los discos no están marcados, es imprescindible indicar su concentración debajo de la placa. Siempre resulta conveniente mantener un orden creciente en la disposición de los discos y una máxima separación entre ellos.
Una vez colocados los discos de ambos experimentos, las placas se incuban en posición invertida durante toda la noche a la temperatura óptima de crecimiento de la bacteria que se esté utilizando. A la mañana siguiente hay que medir el diámetro de los halos de inhibición y anotarlos en el cuaderno.
Resultados:
En el caso del antibiograma, se hará un cuadro de sensibilidad (S) o resistencia (R) para cada uno de los antibióticos frente a esta estirpe, y posteriormente serán utilizados como criterio para la determinación de la bacteria problema. El criterio a seguir, internacionalmente reconocido, será:
Sensible (S) si el diámetro del halo es mayor de 15 mm Resistente (R) si el diámetro del halo es menor de 13 mm Intermedio (R/S) si el diámetro del halo está comprendido entre 13 y 15 mm
En el caso del ensayo cuantitativo se representará el diámetro del halo frente al logaritmo de la concentración correspondiente. Los puntos obtenidos entonces se ajustarán a una recta, de la que se extrapolará la concentración necesaria para generar un halo de 15 mm, que será considerada como la concentración mínima inhibitoria (CMI) de este antibiótico frente a la bacteria ensayada.
ACTIVIDAD CATALASA
Se trata de un ensayo muy simple que intenta determinar si la bacteria problema tiene capacidad para degradar el peróxido de hidrógeno, uno de los agentes oxidantes producidos como consecuencia de determinadas reacciones metabólicas oxidativas propias del metabolismo aerobio. La enzima encargada de degradar este producto es denominada catalasa y aparece en casi todos los microorganismos aerobios obligados o facultativos. Existen sin embargo organismos anaerobios o microaerófilos que carecen de dicha actividad, constituyendo esta prueba un importante elemento taxonómico.
El ensayo es muy sencillo, pues basta con añadir una gota de agua oxigenada sobre una colonia del cultivo y observar si de ésta se empiezan a desprender burbujas de oxígeno como consecuencia de la actividad enzimática de la catalasa:
2H 2 O 2 ==========> 2H 2 O + O 2
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUAS CONTAMINADAS
La detección de microorganismos contaminantes en alimentos y bebidas constituye una práctica habitual en cualquier laboratorio de Bromatología. Para ello se utilizan medios selectivos, indicadores y generales que nos permiten identificar desde el total de bacterias contaminantes (realmente sólo se detecta una cierta parte de la población total) hasta grupos de bacterias concretas, de especial interés como agentes contaminantes por su posible peligrosidad, o por tratarse de indicadores de procesos sufridos por el producto durante su manufacturado o almacenamiento.
Por razones prácticas, en este experimento sólo vamos a tratar de distinguir la presencia y cantidad de cuatro posibles tipos de bacterias contaminantes:
Escherichia coli Salmonella typhimurium Morganella morganii Enterobacter aerogenes.
El método a seguir consistirá en efectuar una serie de diluciones decimales del agua contaminada en solución fisiológica, siguiendo el esquema que se representa a continuación:
0.1ml
10 -1^10 10 10 MUESTRA -2^ -3^ -4^ -
0.1ml 0.1ml
0.9 ml CC+Mg +
0.1ml 0.1ml
A partir de estas diluciones hay que inocular los siguientes medios:
Para recuento de bacterias totales por ml, hay que extender 0.1 ml de las diluciones 10-5, 10-4 y 10 -3 sobre tres placas de agar común, e incubarlas a 37ºC durante la noche en posición invertida. Tras incubar 24 horas se cuenta el número de colonias y se multiplica por los factores de dilución correspondientes.
Determinación de bacterias fermentadoras de lactosa. Se extiende 0.1 ml de las diluciones 10-4 y 10 -3 sobre dos placas de agar MacConkey, incubándolas de la forma descrita. Una vez crecidas, se cuentan las colonias rojas y las rosáceas y se multiplican ambos números por los factores de dilución. Una vez efectuado el recuento, se toman varias colonias rojas y/o rosas al azar y se extiende un inóculo denso sobre la superficie de una placa de agar EMB, incubando a continuación a 37ºC durante toda la noche. En este medio, confirmativo para E. coli , esta especie debe dar lugar a colonias negras con reflejos verdes metalizados, mientras que Enterobacter da colonias más rosáceas y nunca reflejos. Utilizando este criterio, determinar el porcentaje de E.coli , sobre el total de coliformes.
Determinación de Salmonella y Morganella. Se extienden 0.1 ml de las diluciones 10-5 y 10-4 en placas de agar al verde brillante, y se incuban a 37ºC durante 24-48 horas. Sobre este medio Salmonella
TRANSFERENCIA GENÉTICA ENTRE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
I) Conjugación
Uno de los mecanismos más comunes de diseminación de genes en la naturaleza es la conjugación, un fenómeno mediante el cual una cepa portadora de un plásmido, denominado conjugativo, es capaz de transferir una copia de éste a una bacteria receptora casi siempre de la misma especie. No obstante, existen los denominados plásmidos conjugativos promiscuos, esto es capaces de saltar la barrera de especie y, en ciertos casos, la de género. Este mecanismo es el causante primario de la difusión de genes de resistencia a antibióticos y, por tanto, de la pérdida de efectividad de éstos observada durante los últimos años.
Superpuesto sobre la capacidad de transferencia interespecífica de plásmidos se encuentra la movilización de los genes de resistencia a antibióticos promovida por elementos genéticos denominados transposones. Un transposón es un fragmento de DNA con capacidad para cambiar de localización dentro de la misma molécula de DNA o entre moléculas distintas (ej: plásmido a cromosoma o al revés) y que en muchas ocasiones es portador de genes de resistencia a antibióticos, contribuyendo de esta forma a su diseminación.
Objetivos: Vamos a transferir un transposón que confiere resistencia a Kanamicina desde una cepa de E.coli a una cepa de Salmonella typhimurium , utilizando plásmidos derivados del conjugativo y promiscuo RP4. Como medidas de seguridad, tanto las cepas donadoras y receptoras como los plásmidos que vamos a emplear son derivados inocuos de las formas naturales obtenidos en el laboratorio.
Material biológico:
Plásmido: se utilizará el plásmido pUT (5.2 kpb). Este plásmido contiene el origen de replicación de R6K, que sólo funciona en cepas de E.coli que expresen la proteína П desde un bacteriófago lisogénico λ (λpir), y el origen de transferencia del plásmido conjugativo RP4. El plásmido contiene también el gen de la transposasa ( tnp ) y un gen de resistencia a Kanamicina entre los extremos I/O de recombinación (transferible mediante la actividad transposasa). Como elemento de selección del plásmido, también lleva un gen de resistencia a Ampicilina (una β-lactamasa, bla ). Para que sea transferido, este plásmido requiere otras funciones propias de RP4, que solo se encuentran en la cepa E. coli S17-1λpir. El mapa de restricción del plásmido se presenta a continuación:
Cepas de E.coli : se emplearán las cepas de E.coli CC118λpir y S17-1λpir transformadas con el plásmido pUT. Sólo la cepa S17-1λpir posee la capacidad de transferir el plásmido a otras cepas, pues contiene
en el cromosoma genes de RP4 necesarios para la conjugación. La cepa CC118λpir será empleada como control negativo en la transferencia.
Cepa de Salmonella. Utilizaremos como receptor la cepa de S. typhimurium LB5010-R2 (resistente a Estreptomicina y a Rifampicina). Esta cepa posee otras características especiales: es restricción menos, permitiendo una mayor frecuencia de transferencia, y carece de la proteína П, por lo que el plásmido pUT no puede replicarse en ella.
Material no biológico:
Placas de agar común. Placas de selección: se empleará agar común con Rifampicina (160 μg/ml), Kanamicina (20 μg/ml) y Estreptomicina 100 μg/ml. Solución de lavado. Solución estéril de NaCl al 0.9 % (p/v). Solución de conjugación: Mg SO 4 10 mM (estéril).
Procedimiento:
Crecimiento de las cepas (lo harán los monitores): Se emplearán cultivos de 24 horas crecidos en caldo común conteniendo, para las dos cepas de E. coli Ampicilina (100 μg/ml) y Kanamicina ( μg/ml), y para la cepa de Salmonella , Rifampicina (160 μg/ml). Una vez crecidas, las células serán lavadas por centrifugación y resuspendidas en 1/10 del volumen inicial de Mg SO 4 10 mM.
Sobre una placa de agar común, depositar dos filtros estériles de nitrocelulosa separados (actuarán de soporte sólido para la conjugación). Marcad en las placas debajo de cada filtro CC118 y S17. Añadir 10 μl de la suspensión de Salmonella en cada uno de ellos, dejar que absorba el líquido y añadir sobre uno de los filtros 10 μl de la suspensión de E.coli CC118λpir, y sobre el otro 10 μl de la de S17-1λpir. Incubar toda la noche a 37ºC.
Al día siguiente, tomar cada filtro con las pinzas (en condiciones de esterilidad), introducirlo en sendos tubos estériles. Añadir 5 ml de Mg SO 4 10 mM, agitar intensamente y extender 100 μl en dos placas de selección (Rifampicina 160, Kanamicina 20, Estreptomicina 100). Dejar crecer a 37ºC durante toda la noche.
Resultados: Confirmar la aparición de colonias únicamente en la conjugación entre E. coli S17-λpir y Salmonella. Contar las colonias. Explicad los resultados obtenidos en el cuaderno de prácticas.
II) Transformación
La transformación es un proceso a través del cual el DNA es introducido dentro de un microorganismo. En algunas bacterias la transformación es un proceso natural e inducible que les permite la adquisición de manera activa de DNA exógeno. En otros muchos la transformación puede producirse de forma artificial mediante tratamientos químicos o físicos. En esta práctica vamos a proceder a introducir plásmidos de clonaje en una cepa de E. coli mediante el tratamiento químico de éstas.
Materiales: Cepa de E. coli JM83. Se trata de una cepa carente de actividad β-galactosidasa, aunque dispone de las permeasas específicas de lactosa. En ausencia de plásmidos esta cepa es sensible a ampicilina e incapaz de fermentar la lactosa, por lo que genera colonias blancas en agar lactosado de McConkey.
TITULACIÓN DE UN VIRUS BACTERIANO y TRANSDUCCIÓN
Titular una suspensión de virus consiste en determinar el número de unidades infectivas por ml presente en la misma. En el caso de los virus bacterianos líticos, la titulación se realiza asumiendo que cada unidad infectiva es capaz de producir una placa de lisis sobre un césped bacteriano, lo que es cierto para bajas multiplicidades de infección. Así, determinando el número de placas de lisis producidas al infectar con distintas diluciones de la suspensión de virus, podremos calcular el número de unidades infectivas presentes en la muestra original.
Utilizaremos la estirpe de E. coli JM83 que permite la expresión de un bacteriófago lambda utilizado en ingeniería genética (derivado de λRS45) que porta el gen de la β-galactosidasa bajo el control de un potente promotor de transcripción constitutivo, y un gen de resistencia a kanamicina, de forma que podremos seleccionar y detectar la integración en la práctica simultánea de transducción. Como medios para el cultivo e infección se puede utilizar directamente caldo y agar común a los que se añade siempre Cl2Mg a una concentración final de 10mM, al objeto de evitar la disgregación de los componentes de la cápsida del virus. También se utilizará agar blando, que se obtiene añadiendo 0.6% (p/v) de agar al caldo común (con el Cl2Mg presente), y que tiene como función el permitir una difusión limitada de la progenie vírica tras la lisis de la bacteria. Para el ensayo de transducción emplearemos placas de agar de McConkey con el antibiótico kanamicina.
Procedimiento:
Se prepara un inóculo de la cepa de E. coli a infectar (ojo! NO es la misma que se emplea en la colección) en un medio que contiene 10 mM de MgCl2 y maltosa al 0.2%, y se deja incubando a 37ºC y con agitación durante la noche anterior (Esto lo hacen los monitores para todo el grupo).
Se funde en agar blando en los matraces (con 10mM de MgCl2) y se mantienen en estado líquido en los baños a 50ºC (Los monitores hacen esto).
Preparar diluciones decimales (tantas como indiquen los monitores) de la suspensión de virus utilizando el caldo común con el magnesio.
Disponer 0.2 ml del cultivo de bacterias ya crecido en cinco tubos estériles, y añadir a cada uno 0. ml de tres diluciones consecutivas del virus, siguiendo las indicaciones de los monitores. Homogeneizar suavemente e incubar a 37ºC durante 60 minutos con el fin de permitir la adsorción del virus a la superficie de las bacterias.
Añadir también 0,1 ml de la dilución 10-1a otro tubo con 0,1 ml de la bacteria para la práctica de transducción. Incubar en la estufa como en el punto 4. Hacer un control paralelo con igual cantidad de bacterias, pero sin virus.
0.1ml
10 -1^10 10 10 MUESTRA -2^ -3^ -4^ -
0.1ml 0.1ml
0.9 ml CC+Mg +
0.1ml 0.1ml
Añadir 3-4 ml del agar blando (a 45-50ºC) sobre los tres tubos más diluidos, homogeneizar y extender sobre placas de agar común procurando que no queden burbujas. Dejar que se solidifique este agar manteniendo las placas sobre la mesa durante 5-10 minutos.
Extender directamente los tubos para la transducción sobre placas de selección de McConkey con kanamicina, empleando para ello bolitas de cristal estériles.
Incubar a 37ºC en posición invertida durante toda la noche.
Al día siguiente contar las placas de lisis que se han formado en las placas con el agar blando. Puesto que cada una de ellas corresponde a un proceso de infección por un virus único, multiplicando por los factores de dilución correspondientes en cada caso se podrá determinar el TITULO del fago, esto es, el número de unidades infectivas por ml.
En las placas de Mc con kanamicina observar si aparecen colonias y el color de éstas. La aparición de colonias rojas indicará que el fago se ha integrado en el cromosoma confiriendo a esta bacteria resistencia al antibiótico de selección y capacidad de utilización de lactosa mediante la introducción de genes procedentes de otras bacterias (Transducción).
