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AGENTES BIOLÓGICOS DE INTERÉS VETERINARIO
MANUAL PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA
2 º CURSO DE GRADO EN VETERINARIA
Facultad de Veterinaria
Universidad CEU-‐Cardenal Herrera
Profesores:
Dra. Clara Marín (Coordinadora Microbiología)
Dña. Esther Bataller
Dña. Mª Ángeles Dellas
Dra. Estrella Jiménez
Departamento de Producción y Sanidad Animal, Salud Pública
Veterinaria y Ciencia y Tecnología de los Alimentos.
ÍNDICE
PRÁCTICA 1. MEDIOS DE CULTIVO.
1 .1 Tipos de medio de cultivo 1 .2 Preparación de medios líquidos, sólidos y semisólidos. (Esterilización, dispensar y alicuotar). 1 .3 Manejo de medios preparados. 1.4 Problema práctico PRÁCTICA 2. MANEJO DE MUESTRAS. 2.1 Identificación de la muestra. 2.2 Condiciones generales de la muestra a remitir. 2.3 Técnica para la recolección de las muestras. 2.4 Empaque y sistemas de envío de muestras. 2.5 Procesado de las muestras ambientales: Diluciones y recuentos
2. 6 Problema práctico PRÁCTICA 3. OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE LOS MICROORGANISMOS. 3.1 Procesado de las muestras de origen animal: preenriquecimiento vs cultivo directo en placa. 3. 2 Tipos de siembra. 3. 3 Identificación. 3. 4 Pruebas bioquímicas. 3. 5 Antibiograma. Agentes antimicrobianos y pruebas de susceptibilidad. 3. 6 Problema práctico PRÁCTICA 4. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LOS MICROORGANISMOS. 4.1 Morfología de las bacterias. 4.2 Procedimiento general para toda tinción. 4. 3 Métodos de tinción. 4. 4 Problema práctico ANEXO 1 RESUMEN PRÁCTICA 5. CARACTERÍSTICAS DE LA PRUEBA DE EVALUACIÓN CONTINUA: PRÁCTICO.
ÍNDICE
MANIPULACIÓN DE CULTIVOS Y DEL MATERIAL CONTAMINADO
- Siempre trabajar cerca de la llama de un mechero de gas o alcohol.
- Nunca dejar tubos ni placas destapadas.
- Colocar las placas Petri en posición invertida para evitar que caiga el agua de condensación la cual puede estar contaminada.
- Mantener los tubos con caldo en posición vertical para evitar que se mojen los tapones.
- Abrir los tubos en forma adecuada, flamear la boca del tubo antes y después de efecturse el trabajo.No dejar el tapón del tubo sobre la mesa.Las placas deben ser cubiertas cuidadosamente para evitar que se contaminen.
- Esterilizar las asas de alambre antes e inmediatamente después de usarlas.Nunca dejar las asas sobre la mesa de trabajo sino en frascos especiales y en posición vertical con el alambre hacia arriba.
- Aprender a usar las pipetas adecuadamente: para el trabajo bacteriológico éstas vienen estériles y envueltas en papel. Manipularlas exclusivamente por su extremo posterior, desenvolviendolas en el momento de usarlas.
- Todos los cultivos que se incuben deben de tener las siguientes anotaciones: Nombres ó iniciales de los estudiantes, nombre del microorganismo, grupo de práctica y fecha de siembra.
- En caso de las placas, todas deben incubarse invertidas a menos que sean dadas instrucciones contrarias por el profesor.
- Los tubos deben de estar bien tapados y colocados en la gradilla de metal.
B. SEGÚN SU EMPLEO:
MEDIO CARACTERÍSTICAS EJEMPLO
MEDIOS
DEFINIDOS
QUÍMICAMENTE
En ellos, la cantidad exacta de cada ingrediente es conocida. CALDO CITRATO MEDIOS NUTRITIVOS BÁSICOS O GENERALES En ellos crecen los organismos menos exigentes. AGAR NUTRIENTE MEDIOS ENRIQUECIDOS Llevan incorporadas sustancias nutritivas extras necesarias para el desarrollo de bacterias más exigentes. AGAR SANGRE MEDIOS SELECTIVOS Contienen sustancias que inhiben el crecimiento de determinadas bacterias, pero afectan el desarrollo de otras. AGAR T MEDIOS INDICADORES O DIFERENCIALES Nos permiten identificaciones presuntivas de bacterias por las reacciones bioquímicas que realizan. Algunos llevan incorporados azucares y un indicador de pH, como azul de bromotimol, rojo fenol, rojo de metilo, etc., que hace que cambie de color el medio de cultivo.
AGAR MC CONKEY
MEDIOS DE
CONSERVACIÓN
Son aquellos medios que favorecen que las bacterias que se siembran se conserven viables a temperaturas de
congelación y liofilización. CRIOVIALES CON PERLAS PARA LA CONSERVACIÓN DE CEPAS BACTERIANAS MEDIOS DE TRANSPORTE En los que se mantiene en estado viable las bacterias presentes en una muestra, permitiendo con posterioridad recuperarlas. MEDIO DE TRANSPORTE STUART CARACTERISTICAS DE INCUBACIÓN DE LA PLACA SEMBRADA CON UNA MUESTRA SOSPECHOSA DE PRODUCIR ENFERMEDAD:
1. ATMÓSFERA Según sus necesidades podemos dividir a las bacterias en: Aerobias: Crecen únicamente en presencia de oxígeno (son la mayoría de las bacterias patógenas) Microaerobias: Crecen en presencia de 5-‐10 % de CO 2. Anaerobias: Que son incapaces de crecer en presencia de oxígeno. Anaerobias facultativas: son las bacterias que pueden crecer lo mismo en presencia que en ausencia de oxígeno, pero crecen mejor en presencia del mismo. 2. TEMPERATURA Todas las bacterias tienen una temperatura óptima de crecimiento que puede ir desde 25 a 42º C. La temperatura óptima de la mayoría de las bacterias patógenas es de 37ºC 3. TIEMPO DE INCUBACIÓN 24 -‐48 horas: la mayoría de las bacterias crecen en este tiempo de incubación. 48 -‐72 horas: cuando crecen en algunos medios selectivos. Algunas bacterias son de crecimiento muy lento, como las Mycobacterias que pueden llegar a tardar en crecer hasta 4 meses.
ESTERILIZAR, DISPENSAR Y ALICUOTAR LOS MEDIOS DE CULTIVO
Una vez preparado el medio, éste se debe esterilizar lo antes posible para evitar el crecimiento de microorganismos, Figura 2 :
- Medios sólidos en placa: Tapar el matraz con tapón de algodón graso y cubrir con papel de aluminio para llevar a esterilizar en el autoclave (121º C, 15-‐20 min). Una vez estéril repartir el medio en placas de Petri estériles y dejar en reposo para su solidificación.
- Medios sólidos en tubo (agar inclinado): Tras la ebullición del medio con agar, éste se reparte en los tubos de cristal, de forma que queden llenos hasta aproximadamente la mitad. Los tubos se cubren con tapón (de aluminio) para llevar a autoclavar. Una vez esterilizado, los tubos se disponen en posición inclinada para su solidificación.
- Medios líquidos: Una vez disueltos los componentes del medio en el matraz, repartir en su caso en tubos a razón de 2-‐4 mL por tubo, cubrir con tapón y llevar a esterilizar en el autoclave. Alternativamente, se puede esterilizar el medio en el matraz, y posteriormente repartirlo con la ayuda de pipetas estériles en tubos de plástico estériles.
- Medios semisólidos: Se preparan con concentraciones inferiores de agente solidificante (agar-‐agar). El medio se reparte en tubos. En caso de desear proporcionar condiciones anaeróbicas, existen diversas metodologías para ello. Los medios semisólidos se utilizan para el crecimiento bacteriano a lo largo del tubo. Los niveles de difusión de oxígeno en las distintas capas condicionará el crecimiento de distintos tipos de microorganismos tanto aerobios como anaerobios.
1.4 MANEJO DE MEDIOS PREPARADOS.
- Los medios preparados deben conservarse en refrigeración a temperatura de 4-‐8º C, anotando en ellos el nº de lote y la fecha de caducidad.
- Las placas en bolsas de plástico, en posición invertida y siendo el tiempo máximo de conservación 20-‐30 días. Los tubos se podrán conservar entre 15 días y 2 meses según tengan tapón de metal o de rosca.
- Cada lote de medio preparado hay que comprobar su esterilidad, incubando las placas a 37ºC, durante 24h.
1.3 MANEJO DE MEDIOS PREPARADOS
Figura 2. Esquema de preparación de medios de cultivo
1.1 TOMA DE MUESTRAS
Las muestras deberán venir acompañadas de todos los datos útiles para orientar el diagnóstico. Así, con las muestras se debería incluir, Figura 3: ! Nombre, dirección, E-‐mail, teléfono y fax del médico veterinario. ! Nombre, dirección, E-‐mail, teléfono y fax del propietario. ! Nombre de la explotación pecuaria. ! Dirección. ! Especie, raza, sexo, edad e identificación o nombre del animal o animales. ! Número de animales de la explotación. ! Porcentaje de morbilidad (enfermos) y mortalidad (muertos). ! Sintomatología. ! Tiempo de evolución de la enfermedad. ! Tratamiento efectuado. ! Vacunas aplicadas (tipo y fechas). ! En caso de necropsia, descripción de hallazgos o lesiones macroscópicas. ! Tipo de muestra, fecha y hora de la toma. ! Sistema de conservación utilizado. ! Diagnóstico presuntivo.
PRÁCTICA 2
MANEJO DE MUESTRAS
2 .1 IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA
Figura 3. Muestras correctamente identificadas
LAS CONDICIONES GENERALES DE LAS MUESTRAS A REMITIR
- Muestras de animales vivos afectados o muertos recientemente. Asimismo, muestras de animales no afectados que están en contacto con los anteriores.
- Tomar la muestra de la zona anatómica afectada y lo más pronto posible una vez que empiezan los síntomas. Se tomará de la zona más profunda de la lesión
- Recogida aséptica, ya que los gérmenes contaminantes pueden enmascarar el crecimiento del patógeno.
- Las muestras deberán tomarse antes de la administración de cualquier tratamiento. Las muestras de animales tratados con antibióticos recientemente no son útiles para el diagnóstico bacteriológico.
- La desecación puede hacer que el patógeno no sea visible al llegar la muestra al laboratorio, por lo que la cantidad de muestra deberá ser lo suficientemente abundante para que esto no ocurra. Los hisopos se enviarán en un medio de transporte adecuado.
- Contactar con el laboratorio para el diagnóstico de algunos microorganismos que necesiten medios de transporte o condiciones especiales de envío.
- Cada muestra irá en contenedores separados y si esto no es posible, nunca se mezclarán muestras de aparato digestivo (heces, intestino…) con otras muestras.
- El transporte al laboratorio será lo más rápido posible y en refrigeración a 4 ºC no congelado, Figura 4.
2 .2 CONDICIONES GENERALES DE LAS MUESTRAS A REMITIR
Figura 4. Condiciones generales de las muestras a remitir
Técnica de campo para mastitis La llamada prueba de California Mastitis Test (CMT) Figura 6, es un método de simple aplicación en el campo que permite cuantificar la situación sanitaria clínica con respecto a la mastitis subclínica. Reactivos: California Mastitis Test, CMT Procedimiento:
- Lavar, enjuagar y secar la ubre.
- Con una solución de alcohol al 70% desinfectarse las manos.
- Con la misma solución y utilizando algodón desinfectar los pezones. Dejar secar 2 minutos. Eliminar los dos primeros chorros de leche antes de tomar la muestra.
- Extraer de cada cuarto 3 mL de leche aproximadamente, depositándola en cada una de las copas de la paleta.
- Añadir igual volumen de CMT a cada una de las copas.
- Mezclar durante 2 minutos mediante una ligera rotación circular de la paleta mantenida en posición horizontal. Resultado: Los resultados de la prueba que son aplicables a muestras individuales o muestras a granel procedentes de distintas vacas, se interpretan de la siguiente manera: Interpretación:
- En los primeros chorros de leche procedentes de una sola vaca, una reacción ( + ) se debe clasificar como sospechosa, mientras que (++) o más indican mastitis subclínica. Se recomienda tomar muestras de leche del cuarto o cuartos afectados, y enviar al laboratorio para que se les realice cultivo bacteriológico y antibiograma.
- Una reacción (+) con leche a granel procedente de un rebaño, sugiere que por lo menos el 20% de las vacas lactantes tiene mastitis subclínica, o que un gran porcentaje de ellas está cerca del final de su lactancia. Figura 6. Técnica de campo para mamitis
Las reacciones que se observan con el CMT en relación al número de células somáticas son como sigue: HERIDAS ABIERTAS Y EXUDADOS En heridas abiertas, lo mismo que en exudados y raspados de garganta, los hisopos de algodón previamente esterilizados, son los que ofrecen las mayores ventajas, Figura 7:
- En casos de heridas y exudados en contacto con las partes muy sucias del animal, se debe previamente lavar y secar la zona.
- Con un hisopo estéril, raspar la zona afectada evitando el contacto con cualquier otra parte, introducir dentro de un tubo estéril con 3 mL de medio de transporte.
- Mezclar adecuadamente la muestra con el medio de transporte y romper el mango del hisopo para eliminar la parte que ha estado en contacto con las manos.
- Tapar el tubo evitando contaminar su interior. Identificarlo y enviarlo al laboratorio en refrigeración. ABSCESOS, EDEMAS Y LÍQUIDO ARTICULAR Para obtener éste tipo de muestras, está indicada la punción con aguja fina, Figura 8.
- Depilar, lavar y desinfectar el sitio de la punción.
- Introducir la aguja en forma perpendicular a la zona de punción y a la profundidad necesaria de acuerdo al caso.
- Aspirar la muestra hasta obtener una cantidad suficiente (1-‐ 2 mL)*
- Pasar la muestra a un tubo estéril o bien sellar la punta de la aguja de la jeringuilla con su tapa.
- Identificar y enviar al laboratorio en refrigeración. Figura 7. Presentación de heridas abiertas Figura 8. Presentación de abscesos con exudado purulento
Es la metodología recomendada para la obtención de semen.
- Este procedimiento se realiza mediante palpación rectal estimulando la próstata, las vesículas seminales y la raíz del pene.
- Los frascos o tubos utilizados para la recolección deben estar estériles.
- Las muestras se conservan en refrigeración y deben ser procesadas lo más pronto posible (máximo 2 horas después de la toma de muestra). PLACENTA La recolección de éste tipo de muestras es importante en casos de aborto, para investigación de brucelosis, leptospirosis, listeriosis, vibriosis, etc. El procedimiento a seguir es similar al utilizado para recolección de órganos. 1. Utilizando guante protector, tomar porciones frescas que se encuentren dentro de la vagina. 2. Colocarlas en un frasco estéril de boca ancha. 3. Identificar y enviar refrigeradas al laboratorio. Una muestra de sangre de la madre 2 semanas después del aborto es útil, sobre todo si se sospecha de brucelosis o leptospirosis, para las respectivas pruebas serológicas. FETO
- Limpie el feto de suciedad, estiércol o paja con un guante protector.
- Coloque el feto completo en un recipiente adecuado (bolsa de polietileno).
- Envíe refrigerado al laboratorio. Si se sospecha de infección micótica es importante incluir una muestra de líquido abomasal (cuarto estómago), tomada de la misma forma como se recolectan abscesos o líquidos articulares pero enviando la muestra sin refrigerar. Se debe además recoger una muestra mediante raspado cutáneo del feto, como se describe a continuación, Figura 9: a) Lavar la zona con agua y jabón. b) Desinfectar con alcohol al 70%. c) Dejar secar durante 2 minutos. d) Con una hoja de bisturí, o una placa portaobjetos, raspar la zona afectada. e) Si hubiese pelos afectados, éstos deben arrancarse desde su raíz, con la ayuda de pinzas. Figura 9. Presentación de feto 5 a 6 semanas de edad
f) Enviar la muestra al laboratorio (en caja petri, sobre de papel o entre dos placas portaobjetos), sin refrigerar. En caso de que se sospeche de brucelosis se debe recolectar en forma aséptica el líquido abomasal (cuarto estómago del feto), utilizando material estéril y debe mantenerse en refrigeración hasta su envío al laboratorio. SECRECIÓN VAGINAL Las infecciones uterinas (piometra, endometritis), así como las infecciones localizadas, se manifiestan con la presencia de secreción.
- Introducir en el canal vaginal un espéculo estéril.
- Con un hisopo estéril, realizar barrido del contenido o secreción vaginal.
- Mezclar la muestra con el medio de transporte adecuado y romper el mango del hisopo para eliminar la parte que ha estado en contacto con la mano.
- Identificar y enviar la muestra al laboratorio. Considerando que las muestras biológicas son potencialmente infecciosas, que en estas, está el microorganismo que queremos identificar y que las bacterias se estresan y mueren rápidamente, una vez recogida la muestra, se deben enviar al laboratorio lo antes posible y en condiciones de refrigeración (Figura 10):
- Como medio ideal de conservación, se utiliza la refrigeración, con hielo natural, hielo seco o gel refrigerante en fundas herméticas “frigolines” (existen excepciones descritas en los procedimientos de recolección de muestras).
- La totalidad de las muestras recolectadas deben enviarse utilizando un sistema de empaque en doble caja:
- La caja interna, preferentemente debe ser de un material aislante de temperatura externa, siendo las más recomendadas las cajas de espumaflex por su bajo peso y fácil manipulación.
- Las muestras deberán ser enviadas en recipientes individuales y bien identificadas. Entre cada funda, frasco o recipiente que contenga la muestra, se coloca un material que amortigüe los golpes, mantenga fijas las muestras y absorba la humedad (especialmente cuando se usa hielo natural o hielo seco como refrigerante), puede usarse también espumaflex para éste fin.
- La información básica que acompaña las muestras se envía debidamente protegida, dentro de un sobre y en funda plástica, entre la caja interna y la caja externa.
2 .4 EMPAQUE Y SISTEMAS DE ENVÍO DE MUESTRAS
