PRACTIQUES DE GENÈTICA, Diapositivas de Genética

¡Descarga PRACTIQUES DE GENÈTICA y más Diapositivas en PDF de Genética solo en Docsity!

Identificació de les varietats

salvatge i Bt en plantes de blat

de moro ( Zea mays ).

Les tècniques de manipulació genètica permeten crear noves varietats de plantes, plantes

transgèniques o modificades genèticament (GM), generalment desenvolupades a partir

d'espècies d'interès comercial. Les millores introduïdes en les plantes transgèniques solen estar

encaminades a aconseguir augments en la seva producció o una major supervivència, com ara

major resistència als tractaments amb herbicides, a les plagues d'insectes o les condicions

ambientals adverses.

El blat de moro transgènic de la varietat Bt incorpora el gen d'una protoxina insecticida produïda

pel bacteri Bacillus thuringiensis. Aquesta protoxina adquireix activitat insecticida en l'intestí de

l’insecte quan es solubilitza i mitjançant la intervenció d'una proteasa intestinal específica.

D'aquesta manera, les plantes de blat de moro transgènic Bt presenten major resistència a les

plagues d'insectes que les plantes no modificades genèticament.

Per a realitzar controls dels organismes transgènics s'han desenvolupat metodologies basades en

l'anàlisi de proteïnes i de DNA, que permeten detectar, identificar i quantificar la presència o

absència de material transgènic tant en aliments processats, semiprocessats o en matèries

primeres

Identificació de les varietats salvatge i Bt en plantes de

blat de moro ( Zea mays ).

Identificació de les varietats salvatge i Bt en plantes de blat de moro ( Zea

mays ).

1) Ex tracció de DNA.

1.1) Digestió.

Introduïm un tros de fulla de blat de moro (aproximadament 1 cm

2

dins d’un eppendorf, hi afegim 100 μl de tampó de digestió TT i ho

triturem.

Afegir-hi 300 μl més de tampó de digestió TT.

Afegir-hi 20 μl de proteïnasa K (20 mg/ml), s’incuba una hora a l de proteïnasa K (20 mg/ml), s’incuba una hora a

56ºC.

1.2) Extracció fenol-cloroform.

Afegir 250 μl de fenol + 250 μl de cloroform: alcohol isoamil (24:1) en

campana.

Pic de vòrtex i centrifugació 5 min.

Recuperem la fase aquosa (400 μl) amb micropipeta.

1.3) Precipitació amb etanol.

Afegim 25 μl de NaCl

Afegim 2 volums (800 μl) d’etanol absolut a -20 ºC

Invertim el tub 2-3 vegades i centrifuguem 5 min.

Aboquem el sobrenedant.

Afegim 800 μl d’etanol 70% a -20 ºC al tub i centrifuguem 5 min.

Pipetegem el sobrenedant i assequem el pellet (1 min a 94 ºC).

Resuspenem en 100 μl de tampó TE.

Homogeneïtzador

En aquesta pràctica farem

una digestió del teixit

química (Tampó TT +

Proteïnasa K) i mecànica

(Homogeneïtzador)

Identificació de les varietats salvatge i Bt en plantes de blat de moro ( Zea

mays ).

1) Ex tracció de DNA.

1.1) Digestió.

Introduïm un tros de fulla de blat de moro (aproximadament 1 cm

2

dins d’un eppendorf, hi afegim 100 μl de tampó de digestió TT i ho

triturem.

Afegir-hi 300 μl més de tampó de digestió TT.

Afegir-hi 20 μl de proteïnasa K (20 mg/ml), s’incuba una hora a l de proteïnasa K (20 mg/ml), s’incuba una hora a

56ºC.

1.2) Extracció fenol-cloroform.

Afegir 250 μl de fenol + 250 μl de cloroform: alcohol isoamil (24:1) en

campana.

Pic de vòrtex i centrifugació 5 min.

Recuperem la fase aquosa (400 μl) amb micropipeta.

1.3) Precipitació amb etanol.

Afegim 25 μl de NaCl

Afegim 2 volums (800 μl) d’etanol absolut a -20 ºC

Invertim el tub 2-3 vegades i centrifuguem 5 min.

Aboquem el sobrenedant.

Afegim 800 μl d’etanol 70% a -20 ºC al tub i centrifuguem 5 min.

Pipetegem el sobrenedant i assequem el pellet (1 min a 94 ºC).

Resuspenem en 100 μl de tampó TE.

El fenol i el cloroform són dos

dissolvents orgànics que ens permeten

separa les fases del llisat, d’aquesta

manera, els lípids quedaran retinguts a

la fase orgànica, les proteïnes a la

interfase mentre que els àcids nucleics

quedaran resuspesos a la fase superior

(aquosa). Cal ser molt curós i en aquest

pas només recuperar la fase aquosa.

Identificació de les varietats salvatge i Bt en

plantes de blat de moro ( Zea mays ).

2) Comprovació de les extraccions d’ àcids nucleics de les 8 plantes en

gel d’agarosa a l’1%

La primera banda correspon al DNA genòmic , com és lògic és la

banda amb un recorregut més curt degut a la seva mida

Seguidament apareix una banda de DNA mitocondrial.

Més avall poden aparèixer bandes del RNA ribosomal

Identificació de les varietats salvatge i Bt en

plantes de blat de moro ( Zea mays ).

3) PCR

Com que l’objectiu és identificar quines plantes són transgèniques muntarem dues PCRs. Una PCR porta els primers pel gen

que codifica pel 18s que tenen totes les plantes Zea mays i l’altra PCR porta els primers pel gen Bt , que només tenen les

plantes transgèniques.

Per fer les PCRs farem dos grups de treball, cada grup treballarà amb 4 plantes i mirarà quines d’elles són transgèniques.

Omple les següents taules amb els volums que necessites de cada reactiu per fer una mix per a 5 mostres (4 plantes + Control

negatiu) i un volum extra que afegim sempre perquè tot i l’error de pipeteig hi hagi mix per totes les reaccions.

Quan fem una PCR sempre preparem una mix que conté tots els reactius necessaris per cada pas de la PCR

menys la mostra de DNA. D’aquesta manera ens assegurem que les condicions són idèntiques per totes les

reaccions, a més, ens permet afegir un control negatiu per assegurar-nos que l’amplificació (si n’hi ha) és

específica de la mostra i no conseqüència d’una contaminació. Cada mix per tant, portarà sempre el seu control

negatiu (i el control positiu, si el necessita).

Identificació de les varietats salvatge i Bt en

plantes de blat de moro ( Zea mays ).

Després hem de repartir la mix en el 5 tubets que hem preparat, 4 per les plantes i un tubet amb el

control negatiu (per cada una de les PCRs) i finalment a cada tubet afegir la mostra que li pertoca, el

DNA de cada planta en un tub diferent i H

2

O destil·lada al control negatiu.

A continuació posarem els (20) tubets al termociclador on s’executaran els passos de la PCR

(hibridació dels primers, elongació de les cadenes i desnaturalització) aquests tres passos es

repetiran en 35 cicles de canvis de temperatura.

Fase o pas Temperatura

Temp

s

Cicle

s

Desnaturalitza

ció

Desnaturalitza

ció

Hibridació 55º 1’45’’

Extensió 72º 1’45’’

Identificació de les varietats salvatge i Bt en

plantes de blat de moro ( Zea mays ).

4) Comprovació de la PCR

1 2 3 4 5 6 7 8 Ctrl- Ctrl-

1 2 3 4 5 6 7 8 Ctrl- Ctrl-

PCR gen Bt

PCR gen 18s