¡Descarga Pràctiques genètica y más Ejercicios en PDF de Biología solo en Docsity!
Pràctiques de Genètica. Curs 2012-
PRÀCTIQUES DE GENÈTICA. CURS 2012-2013.
ÌNDEX:
A. ANÀLISI DE MOSQUES MUTANTS. 1
A1. CONEIXEMENT I MANIPULACIÓ DE D. MELANOGASTER****. 1 A1.1. Cicle biològic. A1.2. Identificació dels sexes. A1.3. Manipulació de les mosques. A1.4. Obtenció de femelles verges. A1.5. Mutants utilitzats. A2. ANÀLISI D'UN MUTANT I DETERMINACIÓ DEL SEU GRUP DE LLIGAMENT. 6 A2.1. Material per a manipular mosques. A2.2. Procediment experimental. A2.2.1. Observació de mascles i de femelles. A2.2.2. Observació de mosques salvatges i de mosques mutants. A2.2.3. Disseny experimental. A2.2.4. Mutant d’ulls blancs. A2.2.5. Mutant d’ulls taronges.
B. ANÀLISI D’UN PEDIGREE HUMÀ. 16
B1. METODOLOGIA I DESENVOLUPAMENT EXPERIMENTAL. 16
C. GENÈTICA MOLECULAR. 19
C1. METODOLOGIA BÀSICA. 20 C2. PROCEDIMENT EXPERIMENTAL. 21 C2.1. Amplificació de DNA a partir d’una mostra de saliva. C2.2. La identificació de l’espècie d’origen a partir de productes lactis. C2.3. Caracterització molecular del mutant d’ulls taronges de Drosophila melanogaster.
A. ANÀLISI DE MOSQUES MUTANTS.
En aquestes pràctiques s’utilitza com a material biològic a l’espècie Drosophila melanogaster , també coneguda com a mosca de la fruita o del vinagre. D.melanogaster és, des de la seva introducció en l'experimentació genètica l'any 1909 per Castle i Morgan, un material excel·lent de laboratori i ha permès descobrir nombroses i importants lleis genètiques.
Figura 1. Exemplar de D.melanogaster amb fenotip salvatge.
A1. CONEIXEMENT I MANIPULACIÓ DE D. MELANOGASTER****.
A1.1. Cicle biològic.
D.melanogaster és un insecte (dípter) holometàbol que en el seu desenvolupament a partir d’ou, passa per les etapes següents: larva, pupa i finalment imago o insecte adult (veure Figura 2). La durada del cicle, així com de les diferents fases, depèn de la temperatura de cultiu. A 20 ºC el cicle és d’uns 15 dies i a 25 ºC només d’uns 9 dies. A aquesta temperatura, la fase d’ou dura unes 22 hores, la de larva uns 4 dies i la de pupa també uns 4 dies (veure Taula 1).
Taula 1: Cronologia del desenvolupament de D. melanogaster a 25 ºC.
Figura 3. Vista ventral posterior de Drosophila melanogaster
A1.3. Manipulació de les mosques.
Quan s'han de realitzar encreuaments experimentals o bé observar i classificar els individus d'un cultiu, cal anestesiar-los. La cambra d'anestèsia consisteix simplement en un flascó, similar o igual als de cultiu, que es tapa amb un cotó impregnat amb èter etílic, substància anestèsica d'ús normal per a aquest fi (l’èter etílic és tòxic i la seva manipulació al laboratori ha de fer-se amb molta cura).
Per introduir les mosques a l'eteritzador, es destapa aquest flascó i el flascó amb el cultiu de Drosophila , encarant ràpidament les boques d’ambdós flascons en posició vertical. Per tal d'evitar que les mosques puguin escapar-se convé donar, abans de destapar-lo i en posició vertical, uns cops secs al flascó de cultiu. Una vegada encarats els dos flascons, se subjecten les dues boques amb una única mà i es col·loca l'eteritzador en posició inferior; mitjançant uns cops suaus, les mosques cauran en aquest des del flascó amb el cultiu. S'ha d'evitar moviments i cops bruscos ja que sinó podria caure també a l'eteritzador el medi de cultiu. Quan s'han de donar cops als flascons, es recomana de fer-ho sobre una placa de suro que esmorteeix el cop i el soroll.
Una vegada les mosques (o gran part d'elles) s'han transferit al flascó eteritzador, es tapa aquest amb el cotó impregnat amb èter i s'espera uns segons fins que hagin perdut la seva mobilitat. Les mosques anestesiades es col·loquen sobre una cartolina blanca i ja poden ser
observades i classificades. És important no sotmetre les mosques a una exposició massa llarga a l’èter (uns 30 segons és, moltes vegades, suficient) ja que llavors es moren, la qual cosa es veu molt bé perquè les ales i potes queden en posició perpendicular, separades del cos. També s'ha de tenir cura de no impregnar molt el tap de cotó, si goteja èter no s'ha de col·locar i hem d'esperar o eliminar l'excés d’èter abans d'utilitzar-lo.
Normalment, les mosques romanen anestesiades d'aquesta manera d'uns 5 a 10 minuts. Si durant l'observació les mosques comencen a despertar-se, s'han de reeteritzar. Els exemplars eteritzats successivament moltes vegades poden tenir problemes d'esterilitat, el que no és desitjable pels individus que s'han d'encreuar. Per això es convenient eteritzar cada vegada només una quantitat d’exemplars adequada a les nostres capacitats d'anàlisi, repetint el procés fins que s'han analitzat tots els exemplars del flascó de cultiu.
Per a la manipulació del exemplars s'utilitza un pinzell petit, per exemple del nº 0. Els individus que després de la seva classificació no són mai més necessaris són sacrificats col·locant-los en un flascó que conté alcohol de 70º.
Quan s'han de transferir individus anestesiats a un flascó de cultiu, no s'han de tirar directament a l'interior ja que poden quedar enganxats irreversiblement al medi de cultiu i morir. Per tal d'evitar aquest gran problema podem dipositar les mosques sobre la paret de vidre, conservant el flascó en posició horitzontal (sense que rodi) fins que despertin completament.
A1.4. Obtenció de femelles verges.
Una femella de Drosophila pot emmagatzemar i utilitzar l'esperma d'una única inseminació per a la major part de la seva reproducció. Els mascles adults poden copular amb femelles recent emergides de la pupa, diverses hores abans que comencin a ovopositar. Per tant, per a realitzar els encreuaments experimentals cal disposar de femelles verges per a la generació parental, les quals s’acostumen a obtenir de la següent manera: del flascó en el qual estan eclosionant les pupes es retiren totes les mosques, així tenim la seguretat de que tots els individus nascuts en les sis primeres hores són verges i se separen les femelles dels mascles, mantenint ambdós sexes en flascons separats fins el dia de l'encreuament. La virginitat de les femelles així obtingudes pot ser comprovada cultivant el flascó on les hem mantingudes separades dels mascles; si apareixen larves en aquest flascó, no totes les femelles eren verges i per tant s’han de descartar.
A1.5. Mutants utilitzats.
De la gran quantitat de mutants fenotípics, els que s'escullen per a ser utilitzats en el desenvolupament de les pràctiques són d'identificació fàcil, per tal de no dificultar la tasca de l'alumne (Figura 4). Moltes vegades no es fa necessari utilitzar el binocular pel seu reconeixement.
A2. ANÀLISI D'UN MUTANT I DETERMINACIÓ DEL SEU GRUP DE LLIGAMENT.
L'objectiu de la pràctica és analitzar la naturalesa d'una mutació problema (dominància o recessivitat) i el seu tipus d'herència (autosòmica o lligada al sexe) a partir del fenotip. S’estudiaran creuaments a on els progenitors són soques pures homozigòtiques que difereixen en un determinat caràcter.
La primera generació d’un creuament és la generació parental ( P ), la descendència dels progenitors de la generació P es denomina primera generació filial ( F1 ) i la descendència provinent del creuament d’individus de la F1 es denomina segona generació filial ( F2 ).
Dominància i recessivitat. En un locus amb 2 al·lels, l’al·lel que codifica pel tret que sempre s’expressa al llarg de totes les generacions s’anomena dominant (A) i l’al·lel que no s’expressa en combinació amb el dominant s’anomena recessiu (a). Així els individus amb dotació AA i Aa presentaran el fenotip A i els individus amb dotació aa presentaran el fenotip a.
Autosòmic o lligat al sexe. Parlem d’un caràcter autosòmic quan el loci que el controla es troba a un cromosoma somàtic (no sexual) i parlem d’un caràcter lligat al sexe quan aquest es localitza al cromosoma sexual (X, en aquest cas).
En el cas de treballar amb 2 loci, aquests poden provenir de 2 cromosomes diferents i es transmeten independentment o del mateix cromosoma (lligats), es poden entrecreuar o no.
A2.1. Material per a manipular mosques.
-Eteritzador
-Èter
-Placa de suro
-Pinzell
-Cartolina de color blanc
-Lupa binocular
-Tubets de vidre amb i sense medi de cultiu
-Flascó amb etanol 70º.
A2.2. Procediment experimental.
A2.2.1. Observació de mascles i de femelles.
Cal adormir les mosques per poder realitzar una observació amb lupa de diferents característiques. Apunta les característiques principals que et permeten distingir un mascle d’una femella.
Característiques Femella Mascle
Mida
Forma del cos
Extrem de l’abdomen
Potes
A2.2.2. Observació de mosques salvatges i de mosques mutants.
Cal adormir les mosques per poder realitzar una observació amb lupa de diferents característiques.
Mutants que vegis
Caràcter Salvatge
Color dels ulls
Forma de les ales
Forma de les quetes
Forma de les antenes
Color del cos
A2.2.3. Disseny experimental.
Cal establir quin seria el disseny experimental més adequat per poder determinar el tipus d’herència que presenten els diferents caràcters mutats.
A partir d’aquí comencem a treballar en paral·lel amb dues soques mutants (mutants d’ulls blancs, mutant d’ulls taronja). Els procediments s’indiquen per separat a cada soca.
A2.2.4.2. Observació i comptatge de mosques.
Utilitza les taules següents per descriure i comptar les mosques que formen part de l’experiment. Pot ser que no hagis d’utilitzar totes les files.
Generació Fenotipus Descripció del fenotipus Total de mascles femelles^ Total de Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Generació Fenotipus Descripció del fenotipus Total de mascles femelles^ Total de Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
A2.2.4.3- Descripció del tipus d’herència.
Cal fer una hipòtesi sobre el tipus d’herència, a partir de la qual es calculen unes freqüències esperades. Aquestes freqüències esperades caldrà comparar-les amb les freqüències observades mitjançant una χ^2.
Hipòtesi(s)
Què es deriva d’aquesta hipòtesi que ens permet fer un càlcul de les freqüències esperades?
Freqüències esperades
Freqüències observades χ
(^2) g.ll.
Càlcul de la χ^2
A2.2.5. Mutant d’ulls taronja.
A2.2.5.1. Encreuaments.
Fes un esquema del disseny experimental que s’utilitzarà per descriure el tipus d’herència d’aquest mutant. Indica, sempre que puguis, el fenotipus de tots els individus/generacions que surtin a l’esquema. Indica clarament quines parts de l’experiment no han estat realitzades pels alumnes, i a partir de quines mosques ha començat l’experiment d’aquest mutant.
A2.2.5.2. Observació i comptatge de mosques.
Utilitza les taules següents per descriure i comptar les mosques que formen part de l’experiment. Pot ser que no hagis d’utilitzar totes les files.
Generació Fenotipus Descripció del fenotipus (^) masclesTotal de femel^ Total deles Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Generació Fenotipus Descripció del fenotipus (^) masclesTotal de femelles^ Total de Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Taula de valors de la χ^2
Quin tipus d’herència presenta el caràcter d’ulls taronges? Raona la teva resposta.
Pràctiques de Genètica Anàlisi d’un Pedigree Humà
B. ANÀLISI D’UN PEDIGREE HUMÀ.
La descripció de fenotips “estranys” o que criden l’atenció en l’espècie humana es començà a produir a partir del segle XVIII. Des d’aleshores els investigadors desenvoluparen una tècnica simple d’investigació d’aquests casos: l’estudi de la informació familiar. D’aquesta manera, i atès a la impossibilitat de realitzar creuaments controlats en l’espècie humana, el genètic ha de recórrer a l’escrutini dels aparellaments produïts per casualitat.
El membre d’una família que crida l’atenció es denomina propòsit o propositus i el seu fenotip és excepcional. Aleshores, l’investigador rastreja la història del caràcter d’interès cap endarrera en la família i dibuixa un arbre genealògic o pedigree tot utilitzant certs símbols normalitzats (veure Taula A). Observant l’aparició d’aquest fenotip és possible determinar el patró d’herència.
Aquesta metodologia clàssica es denomina anàlisi del pedigree i els genètics l’han utilitzada durant dècades conjuntament amb les dades mèdiques per a determinar el tipus d’herència de molts caràcters. Actualment s’utilitza conjuntament amb les tècniques d’anàlisi molecular.
B1. METODOLOGIA I DESENVOLUPAMENT EXPERIMENTAL.
L’alumne haurà de realitzar un pedigree familiar propi d’un dels cinc caràcters que s’exposen a continuació:
1- Daltonisme : Impossibilitat de diferenciar tots els colors.
2- Pic de la vídua : Línia del cabell termina en un pic al centre del front.
3- Enroscament de llengua : Possibilitat d’enrotllar la llengua.
Pràctiques de Genètica Anàlisi d’un Pedigree Humà
Taula A. Símbols que s’utilitzen en l’anàlisi de pedigree humans
Pràctiques de Genètica Genètica Molecular
C. GENÈTICA MOLECULAR.
Des de fa uns anys que la genètica molecular ha experimentat un espectacular progrés a causa del desenvolupament de tècniques molt eficients com ara la seqüenciació, la clonació i, sobretot, la reacció en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR va ser descrita l’any 1987 per K. Mullis i aquest descobriment li va suposar l'obtenció del Premi Nobel.
La PCR permet fer in vitro moltes còpies (amplificar) d’un fragment concret del genoma d'una manera ràpida i eficaç. L'obtenció de gran quantitat de còpies de fragments concrets de DNA amb una mida màxima de 2 o 3 kilobases (Kb), permet la simplificació de moltes tècniques que d’altra manera no es podrien fer de forma rutinària.
La PCR té dues grans qualitats que la fan una eina realment efectiva i molt simple com a tècnica de laboratori.
1.-L’especificitat, ja que només amplifica una secció molt concreta del genoma. 2.-La robustesa, perquè amplifica a partir de mostres poc purificades.
La PCR te moltes utilitats, entre d’altres s’utilitza per a clonar i seqüenciar gens, per a observar polimorfismes dels fragments de restricció, per a les tècniques de mutagènesi dirigida. De tota aquesta metodologia n’han resultat moltes aplicacions. Algunes d’elles són les que tenen alguna aplicació forense (identificació individual, paternitats, sexatge), els genotipatges de mutacions, la identificació d’espècies i la reconstrucció de filogènies.
Al llarg de les sessions de pràctiques es treballaran les tècniques bàsiques utilitzades en un laboratori de genètica molecular. Es realitzaran metodologies d'extracció de DNA a partir de diferents teixits, electroforesi en gel d'agarosa, reacció en cadena de la polimerasa (PCR), tècniques de genotipatge i protocols de diagnòstic. L'aplicació d'aquestes metodologies permetrà resoldre els següents casos pràctics:
- Amplificació de DNA a partir d’una mostra de saliva.
- Identificació de l'espècie d'origen (vaca, ovella o cabra) a partir de productes lactis.
- Caracterització molecular del mutant d’ulls taronges de Drosophila melanogaster.
Els materials i aparells a utilitzar seran:
MATERIAL APARELLS Puntes de micropipetes Centrífuga Eppendorf Micropipetes Gradetes Estufa Rotulador de vidre Termociclador Guants Fonts i cubetes d’electroforesi Transiluminador Calculadora
