¡Descarga Pràctiques de microscòpia y más Apuntes en PDF de Biología Celular y Molecular solo en Docsity!
PRÀCTIQUES DE MICROSCÒPIA
PRÀCTICA 1: El MICROSCOPI ÒPTIC
Descripció bàsica. Components mecànics i òptics. Maneig del microscopi i observació de preparacions. Micrometria.
1. OBJECTIUS
- Identificar els diferents components del microscopi òptic.
- Conèixer-ne el funcionament.
- Saber-lo utilitzar correctament.
- Mesura de distàncies horitzontals.
- Cura i neteja del microscopi.
2. INTRODUCCIÓ
2.1. El microscopi. Formació de la imatge i augment.
El microscopi és un instrument òptic format per un sistema de lents que dóna lloc a imatges virtuals i augmentades d’ objectes molt petits. Essencialment el microscopi compost, anomenat normalment microscopi, consta de dos sistemes òptics: objectiu i ocular, situats en els extrems d’un tub amb un eix òptic comú. L’objecte que s’estudia se situa davant i a prop del pla focal de l’objectiu , així s’obté una primera imatge real, augmentada i invertida, de l’objecte, anomenada imatge primària del microscopi. L’ocular forma la imatge final virtual, més gran i dreta, de la imatge primària situada a la distància mínima de visió distinta o perfecta -aproximadament a 250 mm de l’ull de l’observador- (vegeu la figura 1.1).
En el microscopi compost l’augment final és el resultat de dues amplificacions o dos augments parcials: un, el de l’objectiu, i l’altre, el de l’ocular. El producte d’aquestes dues quantitats és l’augment total del microscopi, que equival a la relació entre les dimensions de l’objecte i les de la imatge final. Amicroscopi = Aobj x Aoc = LT/fobj x 250/foc
LT: longitud òptica del tub o capçal en mm fobj : distància focal de l’objectiu en mm foc: distància focal de l’ocular en mm 250 : distància mínima de visió distinta o perfecta en mm Aobj: Augment de l’objectiu Aoc: augment de l’ocular Amicroscopi : augment total d’un microscopi Si el tub o capçal inclou d’altres lents ho haureu de multiplicar pel factor del tub (Mtub). Amicroscopi = Aobj x Aoc x Mtub
2.2. Descripció bàsica. Components mecànics i òptics
El microscopi consta d’uns components òptics: l’ocular, l’objectiu i el condensador que tenen com a funció la formació de la imatge; i d’uns components mecànics que serveixen de suport de la part òptica (vegeu la figura 1.2).
Els objectius poden ser secs, quan entre el cobreobjectes i l’objectiu hi ha l’aire o d’immmersió si entre la lent frontal de l’objectiu i el cobreobjectes hi ha una gota d’un líquid, que normalment és l’oli d’immmersió, que té un índex de refracció igual que el de vidre de les lents de l’objectiu, i també del cobre i del portaobjectes, és a dir, de n=1,515 (vegeu les figures 1.4 i 1.5) Els objectius muntats en els microscopis moderns són parafocals, indiquen que tenen la mateixa distància entre l’extrem superior de l’objectiu i l’objecte que s’observa, cosa que facilita el procés d’enfocament. Les principals caracteristiques dels objectius són l’augment i l’obertura numèrica:
- Augment. És la relació entre la grandària de l’objecte i la de la imatge que d’aquest forma l’objectiu. Els augments més freqüents són 4 x, 10 x i 20 x (objectius de petit augment), 40 x i 60 x (objectius d’augment mitjà) i 100 x (objectiu de gran augment).
- Obertura numèrica (ON). Equival al producte de l’índex de refracció del medi (n) que hi ha entre la preparació i l’objectiu pel sinus del semiangle d’obertura (sin β/2) (vegeu la figura 1.4) O N = n · sin β/
En relació amb l’obertura numèrica, hi ha un seguit d’altres factors dels quals depèn la qualitat de la imatge microscòpica i que s’indiquen a continuació:
∗ Poder de resolució (PR). És la capacitat de la lent objectiu per donar imatges separades de dos punts molt pròxims; depèn de l’obertura numèrica (ON) i de la longitud d’ona (λ) de la llum utilitzada. S’expressa per la fòrmula d’Abbe: PR = 1/d on d és la resolució, que és la distància mínima a la qual poden estar situats dos punts perquè les seves imatges es vegin separades, i ve donada per l'expressió: d = cte · λ/ON cte = 0, El poder de resolució és el factor del qual depèn la capacitat d’un objectiu per reproduir en la imatge els detalls d’un objecte. Per aconseguir el màxim poder de resolució d’un microscopi cal emprar objectius d’immersió ja que amb els mateixos augments presenten una obertura numèrica més gran. La resolució màxima del microscopi òptic és de 0,25 μm, mentre que la de l’ull humà és de l’ordre de 0,15 mm. ∗ Poder d’il·luminació. És la quantitat de llum que entra en l’objectiu per formar la imatge. ∗ Camp visual. És la zona de la mostra que pot èsser observada sense moure-la ni canviar l’enfocament. ∗ Poder de penetració o profunditat de focus. És la capacitat d’un objectiu per enfocar de forma simultània diferents plans de la mostra. Els dos primers factors varien en proporcionalitat directa amb l’obertura numèrica, en canvi els dos últims varien en proporcionalitat inversa. En les montures dels objectius hi ha unes anotacions que serveixen per identificar-los i són: aplicació, augment propi, obertura numèrica, longitud del tub i gruix del cobreobjectes pel qual han estat corregits, grau de correcció cromàtica, i si són d’immersió. Per exemple, un objectiu que porti les anotacions 100/1,30 Oil i 160/0,17 (vegeu la figura 1.5) ens indica: 100 x : l’augment de l’objectiu 1,30 : l’obertura numèrica de l’objectiu Oil : objectiu d’immersió amb oli 160 : la longitud òptica del tub o capçal en mm 0,17 : gruix del cobreobjectes de la preparació. Si en lloc de 0,17 hi ha un guió (-), indica que aquest objectiu pot observar preparacions amb cobreobjectes o sense; si hi ha un (0), l’objectiu està construït per observar únicament preparacions sense cobreobjectes.
Els oculars indicadors són els que introdueixen a nivell del pla focal senyals que permeten indicar zones de l’objecte i els oculars micromètrics són els que insereixen reticles o divisions per tal de valorar diferents paràmetres de l’objecte. També hi ha oculars de projecció, fotogràfics i d’altres que tenen aplicacions específiques. En els oculars, s’ha de tenir en compte, a més a més de l’augment, l’anomenat índex de camp visual, que indica l’àrea de la imatge primària visualitzada per l’ocular. Els valors numèrics tant d’un com de l’altre es troben gravats en la muntura de l’ocular.
2.2.2.3. Sistema d’il·luminació Dispositiu que facilita la il·luminació correcta de la mostra per a una acurada observació microscòpia. Generalment consta de: focus lluminós (làmpada), lent col·lectora, mirall i condensador amb diafragma d’obertura (vegeu la figura 1.2)
- Condensador. És un sistema de lents convergents situat a sota de la platina que concentra damunt de la mostra els feixos de llum emesos per la font d’il·luminació (vegeu la figura 1.7). Està equipat amb un diafragma iris (diafragma d’obertura) que permet controlar el con de llum incident sobre la mostra per millorar el constrast de la imatge microscòpica. El condensador és l’element bàsic d’alguns tipus d’il·luminació especials en microscòpia com és el cas del camp fosc i del constrast de fase que utilitzen condensadors especials.
2.3. Mesures en microscòpia
Amb l’ajut de diferents aparells podem obtenir, a més de resultats morfològics, valoracions de tipus quantitatiu, com la mesura de longituds, de diàmetres, de superfícies, de densitats numèriques (recomptes, nombre de cèl.lules per unitat de volum, etc.). Actualment s’utilitzen sistemes de captació, digitalització i anàlisis d’imatges que permeten obtenir de manera semiautomàtica valors morfomètrics.
2.3.1. Mesura de distàncies horitzontals (micrometria) Una manera fàcil de mesurar les cèl.lules i estructures que visualitzem al microscopi és utilitzar el micròmetre ocular o ocular micromètric. Es tracta d’un disc de vidre que porta gravada una petita escala i que es col·loca dins de l’ocular. El valor de cada divisió de l’escala, pel fet d’estar situada a nivell de l’ocular, varia en funció de l’augment amb què s’observa. Per tal de saber el valor de cadascuna de les divisions a un determinat augment, es compara l’escala de l’ocular amb la del micròmetre de platina, micròmetre objectiu o micròmetre objecte, de la qual sabem el valor real. Aquesta operació, rep el nom de calibratge del micròmetre ocular. El micròmetre objecte és una preparació que porta gravat, generalment, un mil·límetre dividit en 100 parts - el portaobjectes ens ho indica: 1/100, 1:100, 0.01 mm - (vegeu la figura 1. 8)
més petit augment en l’eix òptic del microscopi, situeu el selector del voltatge al mínim, desconnecteu la font d’il·luminació i tapeu el microscopi amb la funda. Quan es fan observacions amb el microscopi, és convenient fer anotacions del que s’observa i si és possible dibuixar les estructures més significatives.
3.2. Micrometria
3.2.1. Mètode per calibrar el micròmetre ocular
- Substituïu un dels oculars del microscopi per un ocular micromètric.
- Col·loqueu el micròmetre objecte sobre la platina del microscopi i enfoqueu l’escala. Es veuran en el camp microscòpic dues escales, una que és la que correspon al micròmetre ocular , i l’altre, al micròmetre objecte.
- Desplaceu el micròmetre objecte horitzontalment sobre la platina i gireu l’ocular micromètric de manera que les dues escales es vegin paral·leles i superposades en el camp visual.
- Trobeu el número de divisions del micròmetre ocular (m) que correspon al número de divisions del micròmetre objecte (n) en un interval d’escales determinat. Sabeu que cada divisió del micròmetre objecte val 0,01 mm, per tant, podeu calcular el valor de cada divisió del micròmetre ocular (L). L=n/m x 0,01 mm x 10^3 μm/mm= n/m x 10 μm
- El valor micromètric trobat serveix només per l’objectiu amb el qual s’ha efectuat el calibrat, per tant s’haurà de calcular el valor micromètric per tots i cadascun dels objectius. 3.2.2. Mesures de distàncies horitzontals Per mesurar la longitud de qualsevol mostra només s’ha de substituir el micròmetre d’objecte per la preparació objecte, observar el nombre de divisions que abasta la mostra i multiplicar-ho pel valor de cadascuna de les divisions (L).
3.3. Cura i neteja del microscopi
Atès que el microscopi és un instrument de precisió, tant òptic com mecànic, necessita una cura i una neteja continuada. La pols, els vapors corrossius de reactius químics, el greix de les empremtes i la humitat, són els agents que més perjudiquen a la part òptica del microscopi. Per evitar que es depositi pols en el microscopi, l’heu de tapar amb una funda quan no s’utilitzi; no desmonteu els objectius i els oculars per evitar que entri la pols en l’interior del tub, no toqueu les lents amb els dits. Per netejar les lents frontals dels objectius, i també les lents exteriors dels oculars, de pols i del greix de les empremptes, utilitzeu un drap de lli impregnat amb una mica d’aigua o millor amb una mescla d’alcohol-èter en la proporció 1:3.
Si el microscopi es troba en ambients humits, és propens a la formació de fongs en la superfície de les lents, per evitar-ho, hem de col·locar els microscopis en llocs ben ventilats.
4. QÜESTIONS
Identifiqueu cadascun dels elements òptics i mecànics en el microscopi de pràctiques.
Com es calculen els diferents augments d’un microscopi? Quin és l’augment màxim del microscopi de pràctiques?
Interpreteu cadascuna de les dades gravades en l’objectiu de més augment.
Calculeu el poder de resolució i la resolució que tindrà un objectiu d’immersió de 100 x i d’obertura numèrica 1,4 en el cas que s’utilitzi llum blava de longitud d’ona 450 nm, si l’índex de refracció de l’oli d’immersió és de n=1,5.
Feu un dibuix amb llapis, a augments petit i mitjà, de la preparació de medul·la de saüc.
Observeu i dibuixeu preparacions de la safata amb els objectius de 4 x, 10 x i 40 x seguint el procediment indicat en l’apartat 3.2.
- Calibreu l’ocular micromètric. Calculeu el valor de les divisions de l’ocular micromètric en els diferents augments. Comproveu que els micròmetres de platina porten indicat el valor de cada divisió de l’escala, normalment 0,01 mm. Valor de l’ocular micromètric en (^) μμμμm Objectiu de 4 x Objectiu de 10 x Objectiu de 40 x Objectiu de 100 x
5. BIBLIOGRAFIA
Bradbury, S. (1989). An introduction to the Optical Microsocope. Microscopy Handbooks, 1. Oxford University Press-Royal Microscopical Society. Oxford
Locquin, M. i Langeron, M. (1985). Manual de microscopia.. Labor. Barcelona
Nachtigall, W. (1977). Microscòpia.. Omega. Barcelona
