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electrónica.!Histoquímica.!Inmunocitoquímica.!Autorradiografía.!Aislamiento!de!
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Microscopía: Tipos, Resolución y Aplicaciones en la Biología Celular, Apuntes de Biología Celular
Una introducción a la microscopía, sus tipos, su poder de resolución y sus aplicaciones en el estudio de las células vivas. Se incluyen conceptos como aumentos, límite de resolución, contraste y diferentes modalidades de microscopía óptica y electrónica. Se mencionan técnicas como fluorescencia, confocal, polarización, interferencia, sombreado metálico, criofractura y criograbado, histoquímica, inmunocitoquímica, hibridación in situ y autorradiografía.
Tipo: Apuntes
2019/2020
1 / 51
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Tema 1.- Técnicas de estudio en Citología e Histología: Microscopía óptica y electrónica. Histoquímica. Inmunocitoquímica. Autorradiografía. Aislamiento de células y cultivos celulares. Fraccionamiento celular.
Las células y las estructuras celulares son
demasiado pequeñas para ser observadas a
simple vista
MICROSCOPÍA: tipos de microscopios
(campo claro) Confocal https://www.microscopyu.com/
MICROSCOPÍA
Poder de resolución : Distancia a la que se pueden reconocer como diferentes dos puntos próximos:
- ojo humano =230 μm
- microscopio óptico=240 nm (con luz UV y lentes de cuarzo, 150 nm)
- m. electrónico = 3 Å (30 nm) Aumentos : relación entre el tamaño de la imagen y el tamaño del objeto:
- microscopio óptico: 1.000-1.
- microscopio electrónico: 1.000.
¡Aumentos ≠ Resolución!
Microscopio Óptico de campo claro
Aumentos: 1000 - Límite poder resolución: 0,2 μm
Modo de contraste Mecanismo Características Campo claro El contraste depende de la absorción de la luz Utilizado habitualmente con colorantes histológicos (necesarios para distinguir las estructuras o componentes) Contraste de fases Contraste diferencial de interferencia (DIC) convierten las diferencias en el índice de refracción de las estructuras en diferencias de intensidad luminosa Utilizado para células vivas y muestras sin teñir. El de interferencia produce efecto de relieve Campo oscuro Observación de luz dispersada por las estructuras Produce imágenes de los contornos de células y orgánulos, que pueden aparecer brillantes sobre fondo oscuro.
MICROSCOPÍA ÓPTICA
Célula en cultivo vista con microscopía de luz blanca, contraste de fases e interferencia
Polarización Detecta birrefringencia causada por la organización supramolecular Utilizado para estudiar estructuras regulares (microtúbulos y fibras de colágeno); Fluorescencia Ilumina la muestra con luz UV para excitar la emisión de fluorescencia por parte de la muestra Se utiliza en combinación con marcajes específicos con fluoróforos apropiados Confocal (^) Barrido de la muestra con rayo laser y elaboración de la imagen con un software específico Habitualmente usado con marcadores fluorescentes. Imágenes muy nítidas. Posibilidad de reconstrucciones tridimensionales
MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA
Células en cultivo. Microfilamentos marcados con un fluorocromo verde (FITC) Algunos componentes celulares son autofluorescentes. Otros se pueden marcar con moléculas fluorescentes (fluorocromos/fluoróforos) mediante tratamientos físicos, químicos o de ingeniería genética.
MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA
MICROSCOPÍA CONFOCAL
Iluminación con láser mediante barrido sobre un plano y captación de un solo plano focal.
Ameba visualizada con microscopía de interferencia y marcaje de filamentos de actina con microscopía de fluorescencia convencional Células en cultivo observadas con microscopía confocal : cromatina en azul, microfilamentos en verde, mitocondrias en rojo
Estudio mediante FRAP del movimiento de la galactosiltransferasa entre el RE y el AG en células de mono. Cinética de proteínas: fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)
Interacciones entre proteínas: Fluorescence resonance energy transfer (FRET) Thr FRET: fenómeno mediante el cual un fluorocromo (donador) al ser excitado transfiere energía a otro fluorocromo (aceptor) que se encuentra a una distancia inferior a 10 nm. Permite estudiar distancias e interacciones entre moléculas, que se marcan con los fluorocromos.