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Cromatografía práctica número 6, cromatografía HPLC
Tipo: Guías, Proyectos, Investigaciones
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Ciclo: 20/2 | Grupo: 3IM77 | Fecha de entrega: 01 /1 2 /
Objetivos.
línea base. Durante cromatogramas isotérmicos los programas pueden aumentar automáticamente con el tiempo la sensibilidad a la pendiente, asegurando su habilidad para detectar los picos agudos iniciales y los picos bajos y chatos más retardados con la misma precisión. En el caso de picos fusionados es posible asignar el área a cada componente proyectando perpendicularmente el mínimo del valle a la línea base corregida. Algoritmos especiales distribuyen el área de componente en el caso de picos sobrepuestos. También en el caso de picos sobre colas de otros picos es posible distribuir las áreas de cada pico de forma coherente (Fig. 2.9). Habitualmente se utilizan identificadores como los mostrados en la figura 2.10 para conocer el modo en que el ordenador ha integrado cada pico. En el cromatograma hay uno o más picos, que es una respuesta a la presencia del analito dentro de la columna cromatográfica. El área y la altura corresponden al espacio debajo del pico, y la altura corresponde a la altura a la que el pico alcanza su punto. Se puede utilizar para calibrar el cromatograma, ya que a medida que aumenta la concentración del analito aumentará el área y la altura, por lo que si se realiza algún análisis estándar sobre ciertos compuestos se pueden analizar y observar la composición y ambos. Uno (área o altura) aumenta linealmente. Propiedades que debe cumplir un líquido para ser usado como fase móvil en HPLC. El uso como fase móvil es esencial porque sus propiedades deben mantenerse dentro de un rango estrecho aceptable. Además, estas características también afectarán la elección del disolvente de disolución y la preparación de la muestra. La selección final del disolvente más adecuado se basará en los siguientes principios básicos:
Deriva. Es la variación de la señal de base a lo largo del tiempo, que origina una variación lenta y progresiva de la línea de base. Sensibilidad. Se define como la mínima concentración o cantidad de soluto que debe pasar por el detector para que la señal a que éste da lugar sea dos veces mayor que la del ruido de fondo. Este parámetro indica la cantidad mínima de soluto que es posible detectar, y es dependiente del ruido del detector. Rango dinámico. Es el rango de concentraciones de soluto entre las cuales el detector produce una respuesta dependiente de la concentración de soluto a la salida de la columna.
Creación de un método de análisis usando el programa Chromera: Presionamos el botón método, para cargar o editar un método que ya exista o podemos crear un nuevo método: Nos dirigimos a la parte de crear un nuevo método: En esta sección podemos darle nombre al método, darle un grupo donde será darle una carpeta donde se guardará todos los métodos cromatográficos que se van a utilizar, se le puede dar una descripción al método e inclusive hacer notas acerca de este. Después de darle los argumentos necesarios en la ventana anterior, nos dirigimos a la edición del método, el sistema responde con:
En primera instancia, nos dirigimos al detector, en la imagen se muestra que se tiene un detector UV – VIS, los datos que se recibirán del cromatógrafo serán de 5.0 datos por segundo que se irán almacenando y de tiempo final será de 6 minutos, no de 0 como se muestra, el 0 es porque se está creando un nuevo método. También se modificará la longitud de onda a la que se hará el análisis, como se tiene un detector UV – VIS de longitud de onda variable, entonces eso significa que si se quiere seleccionar mas de una longitud de onda se puede hacer, cada cierto tiempo se puede cambiar la longitud de onda porque se puede trabajar mejor los análisis dependiendo de la absorbancia de cada uno de los analitos que se trabajarán. En este caso la cafeína se tiene una longitud de onda de 254 nm, por lo tanto el inicio del análisis se tendrá dicho valor y se va a realizar automáticamente una reducción de la señal a cero. En el apartado de eventos de tiempo en el caso de esta práctica no se colocará ningún valor. Después de este apartado del detector, se modificará la bomba, el sistema responde con: La bomba puede trabajar de dos maneras, de forma isocrática o de forma gradiente de fase móvil, en este caso se trabajará de forma isocrática, el tiempo de equilibrio es de 30 minutos. El Flujo en Standby será de 0.2 mililitros por minuto, es decir, cuando la computadora se da cuenta que no hemos estado trabajando con el cromatógrafo y sigue funcionando la bomba entonces poco a poco, la computadora baja dicho flujo a 0.2 para no desperdiciar fase móvil, generalmente inicia cuando se lleva 30 minutos de no haber inyectado, de no haber hecho ningún tipo de modificaciones a nuestro cromatógrafo, estos dos son asuntos de seguridad, al igual que después de 2 horas de no estar atendido el software, también se frena la bomba, es decir tendrá un valor de 120 minutos en el apartado de “Stop Time After Equil”. En nuestro caso el límite máximo de presión que soporta nuestro equipo esta configurado a 6000 PSI, por último el límite mínimo de presión será de 0 PSI. Para poder trabajar con la bomba se debe establecer dos pasos, el primer paso será el de tiempo de equilibrio, este servirá para cuando se establezcan las condiciones cromatográficas también les demos un minuto para que todos los flujos y composiciones
¿Cómo se usa el programa Chromera para obtener los datos contenidos en un cromatograma?: Se hace referencia a la Práctica número 5: Encendido y apagado de un equipo de cromatografía de líquidos de alta resolución, HPLC, ya que en ella se encuentran los pasos a seguir para el apagado del equipo. Cuando ya se tiene un cromatograma terminado se buscará los reportes. Los reportes se encuentran en la pantalla principal en el botón de Reportes. Aparecerá una ventana de todos los datos de nuestro experimento. Escribir la información necesaria para poder distinguir los cromatogramas.
Resultados experimentales. Concentración mg/L tR (minutos) A (uA.s) H (uA) A/H (s) 10 3.356 361272 36852 9. 30 3.371 1115532 122462 9. 50 3.387 1689220 186764 9. Análisis de resultados.
0 10 20 30 40 50 60 tR (minutos) C (mg/L) Concentración vs Tiempo de retención y = 34105x + 24155 R² = 0. 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000 1600000 1800000 2000000 0 10 20 30 40 50 60 A (uA.s) C (mg/L) Concentración vs Área de pico
Cálculos experimentales. De acuerdo con nuestra muestra problema: 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑦𝑒𝑐𝑐𝑖ó𝑛: 20 𝜇𝐿 Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑖𝑐𝑜: 817320 𝜇𝐴. 𝑠 Tenemos que: 𝑦 = 34105 𝑥 + 24155 , donde y es el área de pico y x es la concentración, por tanto, si despejamos la concentración queda de la siguiente manera: 𝑥 = 𝑦 − 24155 34105 = 817320 − 24155 34105 = 23. 2566 𝑚𝑔 𝐿 = 2. 32566 𝑥 10 −^5 𝑚𝑔 𝜇𝐿 ∗ 20 𝜇𝐿 = 4. 65132 𝑥 10 −^4 𝑚𝑔 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑓𝑒í𝑛𝑎 = 0. 4651 𝜇𝑔 De acuerdo con nuestra muestra problema: 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑦𝑒𝑐𝑐𝑖ó𝑛: 20 𝜇𝐿 𝐴𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑖𝑐𝑜: 16932 𝜇𝐴 Tenemos que: 𝑦 = 3792. 4 𝑥 + 1190 , donde y es la altura de pico y x es la concentración, por tanto, si despejamos la concentración queda de la siguiente manera: 𝑥 = 𝑦 − 1190
Análisis de resultados y conclusiones. Con base a los datos obtenidos, se pudieron hacer dichas gráficas para una mejor representación y análisis de estos. Como podemos observar conforme nosotros vamos aumentando la concentración va aumentando de una forma ligera el tiempo de retención, esto puede ser causado por la cantidad de analito inyectado qué pasará por la columna. En este caso vemos que no hay tanta importancia ya que la diferencia son de uno o dos segundos entre los tiempos de retención, es decir que puedo considerar que el tiempo de retención es constante, aunque se vea la tendencia ascendente se puede considerar que es una línea horizontal ya que es mínima la diferencia. De la misma manera conforme vayamos aumentando la concentración, aumentará el área por consecuencia al igual la altura, esto es debido aquí si se tiene mayor cantidad de analito, es decir mayor concentración, aumentara el ancho de banda lo que va a generar una señal más grande qué va a ser presentado o mejor visto en el cromatograma, es decir será un pico mucho más alto y ancho. También podemos concluir que la técnica de HPLC utiliza elevadas presiones para incrementar la velocidad de separación de los analitos, reduciendo su difusión y mejorando la resolución de la cromatografía. Como consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser más sofisticado y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatografía. El alto costo de la técnica se ve influenciado por el costo de los disolventes de alta pureza, las columnas de alta resolución más rápidas y con menores dimensiones presentan esta ventaja del mínimo consumo de disolvente y menor cantidad de muestra requerida.
