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““TéTéccnniiccaass uuttiilliizzaaddaass eenn HHeemmaattoollooggííaa FFoorreennssee””
El Elaabboorróó:: LLeettiicciiaa CCaarrrreeññoo RRiiooss
OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN
Reafirmar la importancia del estudio laboratorial de las manchas hemáticas con fines forenses.
Conocer el fundamento químico de las técnicas forenses de laboratorio.
Difundir la importancia de la identificación humana mediante la sangre.
Ampliar nuestros conocimientos respecto al estudio sexológico de muestras biológicas con fines forenses
JUSTIFICACIÓN
El objetivo prioritario de la ciencia Criminalística consiste en la identificación de los sujetos activo y pasivo del delito, de ahí que durante el progreso de esta ciencia han surgido variedad de procedimientos y técnicas que con su aplicación se han ido perfeccionando y en otros casos descartando. Para efectuar la individualización de personas se emplean métodos diversos. Todos son importantes, y no obstante unos sean más efectivos que otros, al aportar datos más infalibles, ninguno debe descartarse, pues en ocasiones el resultado de una identificación plena obedece al uso vinculado de varios de estos métodos. Procedimientos directos de identificación policial y medicolegal^1 tales como la fotografía, el retrato hablado, la papiloscopía y la antropometría, sumados a métodos indirectos como la serología y hematología, hacen posible el propósito anteriormente mencionado.
(^1) SILVEYRA, Jorge O. “Sistemas de Identificación Humana” 1ª edición. Ed. La Rocca, Buenos Aires 2006. p. 241.
INTRODUCCIÓN
En la identificación de delincuentes, enfermos mentales con amnesia, menores sin documentos, víctimas de homicidio, etc., resultan de utilidad los diferentes métodos de identificación hematológica que se mencionarán en la presente investigación. Hay diversos tipos de técnicas forenses de laboratorio, en especial las que se refieren al tejido hemático. Se trata de métodos bioquímicos^2 que evalúan los antígenos eritrocitarios (grupo sanguíneo), antígenos de histocompatibilidad (HLA), proteínas plasmáticas y enzimas eritrocitarias, las cuales no son útiles en la identificación de cadáveres, ya que se alteran rápidamente luego de la muerte. Estas características son de gran utilidad ya que son marcadores que se transmiten obedeciendo a las leyes mendelianas de la herencia. Otro factor sumamente importante es el ADN.
A continuación enlistaremos las técnicas citadas para consecutivamente explicarlas en los temas posteriores: Determinación de grupo sanguíneo en sangre fresca y en manchas de sangre; técnicas de orientación y de confirmación, como el diagnóstico genérico (¿de qué es la mancha?), diagnóstico individual (¿es humana o animal?) y diagnóstico específico (¿a quién pertenece?) de presuntas manchas de sangre encontradas en el lugar de la investigación criminal. Asimismo, profundizaremos en las técnicas laboratoriales aplicadas a muestras biológicas tales como saliva, semen, orina, entre otras, las cuales nos serán de utilidad al conocer su diagnóstico genérico, específico e individual. Finalmente, mencionamos que las propiedades de la sangre referidas en los párrafos anteriores, pueden ser determinadas a través de diversas técnicas utilizadas en hematología forense. Dichas propiedades y los métodos que se utilizarán (que ya se han señalado) serán explicadas en el desarrollo de este trabajo. Veamos.
(^2) SILVEYRA, Jorge O. Open cit
d) Antígenos de histocompatibilidad (HLA). Son un conjunto de proteínas del sistema inmune. Son determinantes de compatibilidad entre dador y receptor de un transplante de órganos y están presentes en todas las células nucleadas del organismo, aunque algunos subtipos se distribuyen en forma más limitada: sobre linfocitos B, macrófagos, espermatozoides, etc. Presentan en su conjunto un rango de probabilidad de exclusión de aproximadamente 95%.
e) El ADN. Químicamente está constituido por un encadenamiento de elementos básicos que se podrían comparar con otras letras de un alfabeto. Estos elementos básicos serían equivalentes a letras químicas que se combinan y forman genes, que en conjunto constituyen el genoma del individuo.
TTééccnniiccaass uuttiilliizzaaddaass eenn HHeemmaattoollooggííaa FFoorreennssee
TÉCNICAS
El rastreo hemático en la práctica forense en muchas ocasiones aporta a los tribunales elementos de prueba muy importantes tanto para señalar si una mancha de sangre recogida del lugar de los hechos puede provenir de la víctima o del victimario, o indicar con mayor certeza que no hay similitud entre la sangre hallada y la de la víctima o su asesor. Karl Landsteiner descubre la existencia del sistema ABO en 1901, al observar que la sangre humana tenía características individuales que se manifestaban por reacciones de aglutinación, pues encontró que los eritrocitos de unas personas eran aglutinados o agrupados por el suero sanguíneo de solamente algunos otros individuos. Este hallazgo dio origen al hallazgo de otros grupos como el MN, el P, el sistema Rh y muchos más.
No se trata solamente del grupo sanguíneo de una persona o de sus posibles patologías, para poder diferenciar plenamente a un individuo de los demás es necesario el trabajo de laboratorio con una muestra encontrada durante el rastreo hemático. Los procesos que se pueden seguir son:
1) Determinación del grupo sanguíneo en sangre fresca 1.1 Recolección y preparación de las muestras sujetas a estudio. 1.1.1 En personas vivas. a) Tomar 5 ml de sangre venosa con una jeringa estéril y seca b) Separar el suero por centrifugación c) Hacer una suspensión del paquete globular al 2% en el propio suero de la muestra tomada, para trabajar en tubo de ensayo y al 5% para determinaciones en placa.
1.1.2 En cadáveres. a) Tomar 5 ml de sangre de una arteria o vaso grueso, o bien de la cavidad cardiaca teniendo cuidado de que no se contamine con tejido adiposo b) Separar el paquete globular por centrifugación c) Lavar el paquete globular^3 tres veces con solución salina fría, fresca y estéril d) Hacer una suspensión de esos glóbulos al 2% en solución salina para determinaciones en tubo y al 5% cuando se utilice placa
(^3) Esto significa: depositar una pequeña cantidad de eritrocitos en el fondo del tubo; llenarlo con solución salina; mezclar invirtiendo el tubo suavemente varias veces, centrifugar y desechar el sobrenadante.
e) Observar macro y microscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación a los 30 segundos
1.3 Interpretación de los resultados Si se observa aglutinación en el tubo o pocito A, la sangre corresponderá a ese grupo. De aglutinar en el tubo o pocito B, la sangre será grupo B. La presencia de aglutinación en el tubo o pocito D indicará que el factor Rh es positivo, y de lo contrario (no hay aglutinación) será rh negativo. Cuando no aglutina ni el tubo o pocito A ni el B, el tipo de sangre es O.
2) Determinación del grupo sanguíneo en manchas de sangre seca En muestras de sangre fresca, el problema es más simple ya que se reduce a evidenciar la presencia de los antígenos de los eritrocitos mediante reacciones de aglutinación con antisueros específicos. En manchas de sangre seca, las células se han roto y por lo tanto las pruebas de aglutinación directa no son viables; sin embargo, los antígenos del sistema ABO no se desnaturalizan tan rápidamente debido a la sequedad y sobreviven por algún tiempo, conservando la capacidad de aglutinación antes mencionada. La formación de la reacción antígeno-anticuerpo es la base de todos los métodos empleados en la detección de antígenos en el estroma de las células rojas de las manchas de sangre seca. El método tradicional de absorción-inhibición fue utilizado durante varios años con ese fin, pero es menos confiable comparado con otras técnicas modernas, como la de absorción-elución. Cuando las muestras de sangre seca se retienen sobre un soporte adecuado (ejemplo: fibras textiles), las partículas que se adhirieron, conservan de forma eficiente el material antigénico. Ésta última técnica está fundamentada en un primer proceso de absorción específica entre la mancha problema y su anticuerpo correspondiente; una vez completada la absorción, el anticuerpo sobrante se elimina lavando con solución salina fría. La reacción antígeno-anticuerpo se disocia calentando a 56 °C; el anticuerpo eluído se pone en contacto con glóbulos rojos lavados de propiedades antigénicas conocidas, finalmente la aglutinación indica la presencia de un antígeno de la misma especificidad que el de las células usadas como testigo conocido. La técnica de absorción elusión es actualmente la más satisfactoria para la determinación del grupo del sistema ABO en manchas de sangre seca y también se sabe que puede usarse para los sistemas MN y Rh, aun cuando en el primero sus antígenos son más difícilmente detectables por la inespecifidad y mala calidad de los antisueros disponibles. Y en el caso del Rh se requiere mayor cantidad de muestra por tener que estudiarse el Rh propiamente dich y los otros grupos del sistema. La técnica de absorción-inhibición debe ser empleada de todas maneras simultáneamente a la anterior para la determinación de grupo en manchas de sangre, y por otra parte es importante señalar que es el procedimiento de elección en la
determinación de grupo en saliva y semen, fluidos orgánicos en los que el antígeno se encuentra en forma soluble.
2.1 Técnica de absorción-elución para la determinación del grupo sanguíneo en el sistema ABO La determinación de grupo sanguíneo en una muestra de sangre seca impregnada en ropas u otras superficies similares es un caso que se presenta frecuentemente en los laboratorios periciales. Para llevar a cabo tal estudio, la técnica más conveniente es la de absorción-elución.
2.1.1 Material empleado a) Sueros hemoclasificadores para el sistema ABO b) Metanol c) Na 2 HPO 4 d) KH 2 PO 4 e) NaCl
Tratamiento con antisuero. El Ac se une a su Ag específico
El exceso de ac se remueve mediante lavados
1 2
Si hubo reacción Ag-Ac, uno y otro se separan al eluir por calentamiento, quedando el Ac en la fase líquida
Se observará aglutinación si el Ag presente en los Gr agregados se encuentra en la muestra problema
3 4
Agregar Gr conocidos
l) Agregar una gota de glóbulos lavados al 2% (del grupo A a los tubos de la hilera anti A, y así sucesivamente) m) Centrifugar durante 30 segundos a 3400 rpm n) Observar la presencia o ausencia de aglutinación
2.2 Interpretación de los resultados Si se observa aglutinación en el tubo de anti A y anti AB, la sangre corresponderá al grupo A. De aglutinar en el tubo de anti B, y anti AB, la sangre corresponderá al grupo B. De aglutinar en el tubo de anti A, anti B, y anti AB, la sangre corresponderá al grupo AB. La presencia de aglutinación en el tubo anti D indicará que el factor Rh es positivo, y de lo contrario (no hay aglutinación) será rh negativo. Cuando no aglutina ni el tubo anti A, anti B ni el anti AB, el tipo de sangre es O.
3) Determinación de enzimas y proteínas en manchas de sangre En los eritrocitos de la sangre existen una serie de sustancias que en Criminalística tienen una gran importancia, debido a que su determinación incrementa el grado de probabilidad en la individualización de las manchas de sangre. Estas sustancias son las enzimas, algunas de ellas con un gran polimorfismo interesante desde el punto de vista forense^5 , cunado son separadas en los componentes proteínicos llamados isoenzimas, de las cuales son particularmente importantes: la Fosfoglucomutasa (PGM), adenilatokinasa (AK), fosfatasa ácida eritrocítica (EAP), etearasa (D EsD), y entre las proteínas cobra particular interés la haptoglobina (Hp), fundamentalmente porque sobrevive determinado tiempo (no muy corto) en manchas de sangre seca.
La PGM y la Hp son las más usadas para fines de individualización y ambas pueden separarse eficientemente por procedimientos de electroforesis. La importancia de su separación reside en el hecho de que no todas las personas tienen exactamente las mismas variantes. Las tres variedades más comunes de la PGM son: PGM 1-1, PGM 2-1 y la PGM 2-2. las de haptoblobina corresponden también a la Hp 1- 1, Hp 2-1 y Hp 2-2. Ahora bien, uniendo los resultados inmunológicos a la combinación de éstas proteínas (llamadas también marcadores genéticos), se obtienen las tablas de distribución en la población que dan pie para aumentar las probabilidades de exclusión o márgenes de error. El pionero de la aplicación de del método de separación de enzimas en hematología forense fue Culliford, del laboratorio de la Policía Metropolitana de Londres, quien determinó que pueden ser satisfactoriamente detectadas en manchas
(^5) BALTHAZARD, Víctor. “Manual de Medicina Legal”, Editorial Salvat. 6ª edición, Barcelona, España, 1945
de sangre mediante procedimientos electroforéticos sobre capas de gel de almidón, siempre y cuando se cuente con cantidad suficiente de muestra problema en buen estado de conservación, ya que la posibilidad de encontrarlas va decreciendo con la desecación en el siguiente orden: Sistema ABO, Rh, Hp y PGM, esto es, que los antígenos del primer sistema pueden durar años en condiciones de se evidenciados^6 , los del sistema Rh algunos meses; las Hp semanas, y por último las PGM tan sólo después de unos días. Posteriormente a los estudios de Culliford^7 y sus colaboradores sobre el gel de almidón, es Grunbaum^8 de la Universidad de Berkeley en California, quien se preocupa por la investigación de marcas genéticas y a él se deben las técnicas de electroforesis en Microzona y sobre tiras de acetato de celulosa, que requieren de un tiempo menor en su resolución.
4) Pruebas de ADN Las pruebas de ADN para determinar la paternidad se realizan comparando la secuencia de ADN del padre, del niño/niña y de la madre. La combinación de las secuencias de ADN del padre y de la madre debe dar como resultado la secuencia del niño/niña; solo de esta manera se tendrá una seguridad, generalmente de más del 99%, sobre la paternidad del menor de edad. Los márgenes de error dependerán del tipo de muestra. Las muestras no estándar no siempre garantizan la obtención de un perfil de ADN.
En algunos casos lo que se busca determinar es la línea genética materna, en este caso se recurre al ADN mitocondrial que la madre transmite al hijo/hija y que a su vez es transmitido por los mismos a sus descendientes. Este tipo de pruebas sirve para determinar linajes en varias generaciones y fue utilizado para conocer como ha evolucionado el genoma humano desde la aparición del Homo sapiens, a través de la Eva mitocondrial, la primera madre que dio origen a la humanidad moderna. De ahí que, en cierto nivel generacional, grandes poblaciones humanas comparten una misma ancestra y ADN mitocondrial.
4.1 Procedimiento a) Revisión de la muestra. Las muestras que llegan al laboratorio de genética son revisadas por un técnico que aparta la muestra que ocupará y guarda el resto.
(^6) ADAMS, Elizabeth, et. al., “Phosphatases in body fluids: The differentiation of semen and vaginal secretion”; Metropolitan Forensic Laboratory. London Forensic Science 3, 1974, pp. 57 7 - 62.
8 ADAMS, Elizabeth,^ open cit. ERIC; S., “DNA fingerprints on trial lander in nature”, Vo. 339, no. 6225, junio 15, 1989, pp. 501- 505
5.2 Preparación del reactivo a) Solución de bencidina 0.25 g. de bencidina se disuelven en 175 ml de etanol y se añaden 5 a 10 gotas de ácido acético glacial. Se guarda en un frasco gotero ámbar, en refrigeración. b) al 3%; también en un frasco gotero ámbar.
5.3 Procedimiento: a) Humedecer un hisopo con agua destilada y frotarlo sobre la mancha problema. b) Añadir al hisopo 1 ó 2 gotas de solución bencidina, después de unos momentos de observar que no de coloración con ésta. c) Poner la misma cantidad de sobre el hisopo.
d) En caso positivo aparecerá rápidamente una coloración azul.
6) Técnica de la fenolftaleína o de Kastle-Mayer 6.1 Fundamento químico Esencialmente la rige el mismo principio que se mencionó en la reacción de Adler. La diferencia estriba: a) La fenolftaleína debe ser reducida previamente a fonolftaleína incolora y este reactivo, por su labilidad, debe ser guardado en refrigeración en frasco ámbar. b) Se trabaja en medio alcalino en vez de un medio ácido. c) Se efectuará un calentamiento previo a 100 °C durante un minuto. Se apuntará a continuación el comportamiento de las peroxidasas vegetales, que explicará el porqué de las modificaciones apuntadas: a) Termolabilidad : Se ha confirmado que las peroxidasas vegetales se inactivan por calentamiento a 100 °C. A la misma temperatura las peroxidasas de origen animal son estables. Un período de un minuto a 100 °C servirá para diferenciar una de otra. b) Tiempo : Las peroxidasas de origen animal son muy estables, las manchas de sangre humana dan resultados positivos aún después de varios meses de haberse producido.
Cuando manchas de la misma edad pero de origen vegetal son tratadas de esta manera, dan resultado negativo. c) pH : las peroxidasas de las plantas reaccionan en medio ácido, pero no en medio alcalino. Por esta razón, ésta técnica. A pesar de esto debe efectuarse pruebas testigo sin añadir agua oxigenada a muestras previamente calentadas. Esta técnica es mucho más sensible que la de la bencidina, siendo esta sensibilidad de 1: 1,000,000 a 10,000,000.
6.2 Preparación del reactivo a) Solución de fenolftaleína:
- Fenolftaleína 2g
- Hidróxido de potasio 20 g
- Agua destilada 100 ml.
- Polvo de zinc 20g
Disolver estas sustancias y colocarlas a reflujo con el polvo de zinc hasta completa decoloración. Esta solución madre deberá guardarse en un frasco ámbar en refrigeración y deberá añadírsele polvo de zinc. b) Solución de trabajo: Diluir la solución madre en etanol en la proporción de 1:5; la que también deberá refrigerarse en tanto no se use. c) Solución de agua oxigenada al 3%
6.3 Procedimiento a) Humedecer un hisopo con solución salina, frotar la muestra problema y pasarlo a un tubo de ensaye con 2 ml de la misma solución. b) Calentar un minuto a 100 °C c) Añadir unas gotas del reactivo, esperar unos segundos y d) Agregar agua oxigenada. e) En caso positivo se obtendrá una coloración rosa brillante.
7) Técnica de leuco malaquita verde 7.1 Fundamento químico Se basa, al igual que las anteriores en una reacción de oxidación y reducción. La estructura química de esta sustancia recuerda a la de la fenolftaleína. El prefijo leuco
En la investigación criminalística, no es suficiente con obtener el espectro de la oxihemoglobina, sino que es necesario someter la muestra en una marcha espectral. Algunos autores (Gisbert Calabuig) señalan lo siguiente: a) Se extrae la mancha de sangre con agua destilada b) Se filtra c) Se lleva al espectrofotómetro ultravioleta visible de doble haz, que permita realizar un barrido espectral con registro gráfico; la hemoglobina así estudiada registra bandas de absorción a 575, 540 y 412 nm d) Posteriormente, y a ese mismo tubo, se añaden unas gotas de reductor como el sulfhidrato de amonio recientemente preparado, formándose así el hemocromógeno, con el que se registran bandas de absorción con máximos a 559 y 530 nm En la práctica forense cotidiana en el laboratorio de la PGJDF se ha comprobado que una mancha es de sangre con una metodología mucho más simple y rápida: a) Impregnar un pequeño trozo de 5x5 mm de tela limpia, sin apresto, de color blanco con la muestra problema. b) Colocar la muestra así obtenida en un tubo de ensaye y añadirle 5 ml de agua destilada, dejándola reposar durante 10 minutos para lograr una eficiente extracción; pasado este tiempo filtrar. c) Efectuar el barrido espectral en la zona de espectro visible; se obtendrán tres bandas de absorción; dos finas a 575 y 540 nm y una banda ancha a 412. Este espectro corresponde a la oxihemoglobina. d) Efectuar nuevamente la extracción de la muestra como se indica en el punto 2, pero utilizando en vez de agua destilada, 5 ml de una solución de ferricianuro de potasio al 0.5 %. Al realizar el barrido espectral en la región del visible, se obtendrá una banda a 630 nm banda que corresponderá a la metahemoglobina. e) Sobre la misma celda de muestra, añadir unos gránulos de cianuro de potasio; al efectuarl el registro espectroscópico, deberá desaparecer la banda de la longitud de onda correspondiente a 630 nm y se obtendrá una banda a 540 nm debida a la formación de cianometahemoglobina. Para realizar estas experiencias se utilizó un espectrofotómetro ultra violeta- visible, modelo DH-2ª de doble haz y provisto de monocromador.
9) Técnica de luminol El luminol es el 3 amino-ftalhidracina y el reactivo se prepara de la siguiente manera, en el momento de utilizarse: Solución A. Luminol 0.1 gr. Carbonato de sodio 1 gr. Agua destilada c.b.p. 100 ml. Solución B. Hidracina hidratada al 95% 01 gr. Agua destilada 100 partes
a) Al ml de la solución A, se añade una gota de agua oxigenada e inmediatamente después, 2 gotas de la solución B; b) Se espera un minuto y la mezcla se asperje sobre la zona sospechosa. c) En caso positivo, las manchas de sangre producen luminiscencia. Como reactivo, no altera la mancha, se puede continuar con la metodología normal.
Técnicas de confirmación 10) Cristales de hemina o de Teichman 10.1 Fundamento químico La hemoglobina, cuando es tratada con ácido acético, se separa inmediatamente de las proteínas y del grupo prostético. Durante la hidrólisis la globulina se desnaturaliza. La oxidación del fierro del grupo hem se efectúa más rápidamente en medio ácido que en medio alcalino. Si está presente un halógeno inorgánico como el cloro, se formarán cristales insolubles de cloruro de ferriprotoporfirina o hemina.
10.2 Preparación del reactivo a) Cloruro de sodio 0.1 gr. b) Bromuro de potasio 0.1 gr. c) Ioduro de potasio 0.1 gr. d) Ácido acético c.b.p. 100 ml.
10.3 Procedimiento a) Colocar la muestra problema en el centro de una laminilla de vidrio y poner encima de ella un cubreobjetos. b) Deslizar entre lámina y láminilla por capilaridad, unas gotas del reactivo de Teichman. c) Calentar lentamente y a baja temperatura la laminilla hasta evaporación. d) Dejar enfriar y observar al microscopio. e) En caso positivo se observarán cristales romboidales de color café obscuro.
11) Prueba de Takayama (hemocromógeno) 11.1 Fundamento químico Tanto la ferroprotoporfirina como la ferriprotoporfirina tienen la propiedad de combinarse con otros compuestos nitrogenados por medio de la globulina. Tales compuestos incluyen otras proteínas, hidróxido de amonio, cianuro, nicotina y piridina y los productos resultados se llaman hemocromógenos. Los cristales pueden formarse tanto en medio ácido como alcalino; sin embargo, el reactivo de Takayama es de naturaleza alcalina. 11.1.1 Mecanismo de reacción : El hidróxido de sodio efectúa una hidrólisis alcalina, liberando el grupo prostético de la globina; el fierro del hem en este momento se encuentra como ión férrico (+3) debido a la formación de la metahemoglobina en el proceso de desecación de la mancha de sangre. La carga (+3) del fierro se neutraliza por el ión OH. Calentando la glucosa (a azúcar reducida), se reduce el ión férrico a ferroso (+2) y la piridina se combina con éste para formar un producto cristalino insoluble: el hemocromógeno o piridinferroprotoporfirina. La prueba es más sensible y sencilla que la de los cristales de hemina y no se dan casos de falsas reacciones positivas.
11.2 Preparación del reactivo de Takayama Mezclar: a) Una parte de solución saturada de glucosa. b) Una parte de solución de hidróxido de sodio al 10%
Además la reacción debe efectuarse en condiciones óptimas de temperatura, de pH, de solubilidad de la muestra y de dilución del extracto obtenido de ella. Especialmente la edad y la putrefacción causan degradación de las proteínas de la sangre; la exposición al aire, a la luz solar y a la humedad a menudo producen cambios por oxidación. El extracto de la mancha de sangre debe tener un pH casi neutro y la prueba debe llevarse a cabo a la temperatura del laboratorio (aproximadamente 22 °C) Los extractos deben prepararse en el menor volumen posible, procedimiento que para algunas muestras requiere de 24 hrs. en refrigeración. El tiempo adecuado dependerá de las condiciones de la muestra y el título de dilución deberá ser de 1 a 1,000.
13) Técnica de precipitinas en capilar 13.1 Reactivos a) Antisuero humano precipitante b) Solución salina fisiológica
13.2 Procedimiento a) Cortar un pequeño fragmento de la mancha y extraer en un tubo de ensaye de 12 x 75 cm. con unas gotas de solución salina fisiológica; el tiempo requerido dependerá de la naturaleza de la mancha; normalmente se requieren de 1 a 2 minutos. Si la solución está turbia es conveniente centrifugar y utilizar el sobrenadante. b) Dos gotas del extracto diluido se colocan en un tubo capilar (de tal forma que el líquido humedezca la pared del tubo por el cual es preferible hacer esto con el capilar inclinado). Una cantidad igual de antisuero se absorbe en el mismo capilar de una manera que quede abajo del extracto de la muestra. El tubo se fija perpendicularmente sobre un soporte. c) La observación se hace con luz indirecta y sobre fondo oscuro, la aparición de un anillo de precipitación en la interfase de los dos líquidos indica reacción positiva. d) El resultado es considerado positivo si la precipitación aparece antes de 20 minutos, después de ese tiempo el resultado deja de ser confiable. Es conveniente una vez hecha la extracción, determinar el pH con papel indicador; si la reacción no es neutra, neutralizar: NaOH al 0.1% si la reacción es ácida hasta lograr un pH neutro, o con ácido clorhídrico al 0.1 % si es alcalina. Si existen partículas en suspensión o turbidez, la muestra deberá centrifugarse hasta obtener un líquido transparente. La dilución de la muestra problema deberá tener una concentración de 1 a 1000 misma que se controlará con un testigo a la misma dilución. No se recomienda hacer la extracción en medio tibio o caliente. En cuanto al antisuero precipitante aun cuando puede ser separado en el laboratorio, es preferible obtener productos comerciales y determinar su potencia, efectuando diluciones con muestras de sangre testigo.
14) Técnica de inmunoelectroforesis cruzada para identificar sangre humana 14.1 Fundamento Esta técnica inmunoquímica se basa en las reacciones que se efectúan entre un antígeno que emigra anódicamente y un anticuerpo que emigra hacia el cátodo
durante una electroforesis. Sobre una placa de agarosa, se hacen horadaciones en pares; el antígeno (seroalbúminas y alfa y beta globulinas) se coloca en una de ellas y el anticuerpo (gamma globulinas) en la otra; una vez terminada la electroforesis aparecen bandas visibles de precipitación entre las perforaciones pares de los materiales proteínicos específicos.
14.2 Material y equipo a) Cámara de electroforesis b) Fuente de poder con control de voltaje hasta 500 v, 20 ma y control de tiempo. c) Puentes de papel filtro u otro material absorbente. d) Perforador y extractor de gel aproximadamente 2 mm de diámetro. e) Micropipetas graduadas f) Portaobjetos desgrasados y pulidos.
14.3 Reactivos: a) Suero antihumano completo b) Agar c) Ácido dietilbarbitúrico d) Barbital sódico e) Lactato de calcio
14.4 Preparación de reactivos: a) Buffer para la cámara de electroforesis (pH 8.6).
- Ácido dietilbarbitúrico 1.38 g
- Barbital sódico 8.76 g
- Lactato de calcio 0.384 g
- Agua deinizada c.b.p. 1000 ml b) Buffer para el gel (pH 8.6)
- Ácido dietilbarbitúrico 1.1 g
- Barbital sódico 7.0 g
- Lactato de calcio 1.0 g
- Agua desionizada c.b.p. 1000 ml c) Gel Pesar 2 g De Gel (Difco Agar Especial) y añadir 100 ml de agua destilada, mezclar y agregar 100 ml de Buffer 2.
14.5 Preparación de las placas Sobre una superficie y perfectamente nivelada, colocar los portaobjetos y con la solución de gel, lo suficientemente caliente para facilitar su aplicación, dejar caer con una pipeta y partiendo del centro de la placa 2.5 ml de gel, teniendo cuidado de que su distribución en placa sea uniforme. Una vez solidificado el gel, acomodar las placas en una caja de plástico en cuya base se ha colocado una gasa húmeda para evitar la desecación de gel; conservarlas en refrigeración un mínimo de una hora hasta el momento de su uso, las placas pueden almacenarse en estas condiciones aproximadamente durante un mes. También se pueden almacenar en el refrigerador tubos de ensayo conteniendo 7 ml de gel (c), para ser utilizados en el momento en que
