¡Descarga Técnicas moleculares y más Apuntes en PDF de Biología Molecular solo en Docsity!
TEMA 1: TÉCNICAS MOLECULARES
Técnica que analiza y manipula moléculas como ARN, ADN, proteínas. ej: PCR (ácido nucleico), test antígenos (proteína espicular) y test serológico (sangre → anticuerpos)
Técnica genómica: analiza un gen Técnica transcriptómica: analiza ARN Técnica proteómica: analiza una proteína
1. ELECTROFORESIS: técnica de separación de moléculas en un campo eléctrico y matriz porosa (gel de agarosa para DNA y RNA o gel de poliacrilamida para proteínas).
➔ Las moléculas cargadas negativamente migran desde el polo negativo al positivo. ◆ Ácidos nucleicos: disponen ya de carga - ◆ Proteínas: corre en un gel que le da carga + ➔ Las moléculas con menor peso molecular corren más que las moléculas grandes.
Dependiendo de la molécula a analizar:
- Southern Blot: ADN complementario → ADN
- Western Blot: anticuerpo → proteína
- Northern Blot: muestra → ARN
1.1 SOUTHERN BLOT (E.M Southern): a partir de un fragmento de ADN complementario , se encuentra la secuencia de ADN que buscamos. ➔ Mediante las enzimas de restricción (actividad endorribonucleasa):
FASES DEL SOUTHERN BLOT:
1. Reconocimiento de secuencia corta del DNA de cadena doble mediante EdR 2. Fragmentación del DNA mediante EdR 3. Electroforesis en un gel de agarosa
*Enzimas de restricción o endonucleasas
- Reconocen secuencias de nucleótidos determinadas
- Cortan la doble cadena de ADN
- Extremos romos (vertical) o cohesivos (escalado)
1.3 NORTHERN BLOT: a partir de muestra se detecta fragmento de RNA (cuantitativo y cualitativo) ➔ NO necesita enzimas de restricción
FASES DEL NOTHERN BLOT:
**1. Extracción de RNA en la muestra
- Electroforesis en gel de agarosa
- Transferencia de RNA a membrana
- Fijación de RNA a membrana** mediante UV o calor 5. Hibridación de membrana con sondas etiquetadas 6. Visualización del RNA etiquetado en film de rayos-X
2. PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa): detección de una secuencia específica de DNA mediante amplificación previa de la misma , para identificar el fragmento deseado. FASES DE LA PCR:
- Identificación de región de interés
- Desnaturalización y separación de cadenas : mediante alta temperatura
- Enfriamiento de muestra : para que los primers emparejen bases con el DNA complementario.
- Extensión con polimerasas que extienden el primer para formar el nuevo DNA mediante el termociclador.
- Electroforesis en un gel de agarosa : migración en f(x) de tamaño
- Tinte del gel con la sustancia unida al DNA : para visualizar bajo luz UV
- Comprobación de si es el tamaño adecuado : mediante marcador de tamaño
*En cada ciclo, las cadenas sintetizadas sirven como molde para las síntesis siguientes = se duplica el nº de cadenas en cada ciclo = amplificación es exponencial *Polimerasa: copia cadenas ADN en la duplicación
3. RT-PCR (Reverse Transcription-PCR): a partir de mRNA se quiere saber si un gen se transcribe o no, y en que cantidad.
FASES DE LA RT-PCR:
1. Retrotranscripción: paso de mRNa → cDNA 2. PCR: amplificación del cDNA **3. Electroforesis en gel de agarosa
- Detección del material amplificado**
1.6 PCR vs RT-PCR
PCR RT-PCR
Material de partida DNA RNA
Información Si en una muestra hay una secuencia determinada O NO
Si un gen se transcribe o no, y en que cantidad.
Las dos son técnicas semicuantitativas (se puede cuantificar la intensidad de las bandas pero NO sabemos la cantidad exacta de material resultante amplificado.
5. MICROARRAYS : a partir de muestra se detecta secuencias de macromoléculas (proteínas, DNA, RNA, oligonucleótidos, tejidos) ➔ Permite análisis simultáneo de mil macromoléculas
FASES DE MICROARRAY DE DNA:
**1. Fijación de DNA (sondas) con una secuencia conocida en soporte sólido
- Hibridación de estas sondas fijadas con las moléculas diana (en muestra)** (Si hay hibridación en ambas partes) **3. Emisión de fluorescencia
- Captación y análisis de fluorescencia por un programa informático**
APLICACIONES: ● Estudio del patrón diferencial de expresión entre 2 condiciones: ○ Individuos sanos vs enfermos ○ Tratados vs no tratados ○ Un tejido vs otro ● Predicción de respuesta a un tratamiento ● Detección de mutaciones
6. MÉTODOS INMUNO
Pueden ser mediante método directo o indirecto: Método directo: propio anticuerpo primario que contiene el F ● Pros: más rápido ● Cons: más costoso Método indirecto: se requiere anticuerpo secundario para unirse al primario. ● Pros: más económico, se puede incrementar marcaje ● Cons: más lento
6.1 INMUNOHISTOQUÍMICA: a partir de anticuerpos se detecta y amplifica de un antígeno específico (generalmente es una proteína ) y su localización específica (tisular o citológica) ➔ El anticuerpo secundario se encuentra conjugado a un enzima (HRPO, horseradish peroxidase), que cuando se une un substrato (DAB, diaminobenzidina) produce un producto coloreado (visible al microscopio).
*No hace falta extraer las proteínas, se hace sobre el
propio tejido.
6.2 INMUNOFLUORESCENCIA: a partir de anticuerpos se une, detecta y amplifica de un antígeno específico (generalmente es una proteína ) y su localización específica (tisular o citológica), con una señal fluorescente ➔ El anticuerpo está unido a un F, que emite luz en presencia de una longitud de onda. ➔ También puede ser directa o indirecta. ➔ Ventaja de la fluorescencia: Es más sensible (se distinguen cosas más pequeñas) y se puede trabajar con 2 tejidos a la vez.
*Otra forma de trabajar en tejido es la tinción de:
- Hematoxilina: tiñe estructuras basófilas (Ac. Nucleicos)
- Eosina: tiñe estructuras acidófilas (Citoplasma)
Para ver información sobre morfología celular. Para distinguir tipos celulares.
Inmunocitoquímica: a partir de una reacción de antígeno anticuerpo se localiza proteína.
7. RNA DE INTERFERENCIA: silenciamiento post-transcripcional de genes de manera específica, mediante pequeñas moléculas de doble cadena de RNA (dsRNA) → conducen a la degradación de éste, impidiendo traducción de P. Proteínas que intervienen: - DICER - RISC
VENTAJAS DE LA CDF:
● Análisis de un nº de células específico ● Marcajes en una célula ● Alta sensibilidad y objetividad ● Medidas cuantitativas
INCONVENIENTES DE LA CDF: ● NO da info de localización celular en un tejido ● Necesita suspensión de células individuales ● Costoso ● Destructivo ● NO se puede visualizar células
9. CULTIVOS CELULARES: conjunto de técnicas que permite mantenimiento de células in vitro, conservando propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas MATERIAL: ● Material estéril ● Medios de cultivo ● Cabina de seguridad biológica ● Antibióticos y antifúngicos TIPOS DE CULTIVOS: ● Células eucariotas ● Bacterias ● Virus VENTAJAS: ● Posibilidad de estudiar detalladamente un tipo celular ● Aplicación de fármacos, inhibidores, etc.. INCONVENIENTES: ● Células aisladas
TEMA 2: VIRUS, CÉLULAS Y ORGÁNULOS
1. VIRUS
Definición: Lwoff: entidad celular y potencialmente patogénica con fase infecciosa. ● Posee 1 único tipo de ácido nucleido ● Incapacidad de crecer y reproducirse por fisión binaria ● Carecen de enzimas para producir E Luria y Darnell: entidad que el genoma se replica dentro de células vivas usando maquinaria de síntesis.
Características generales: ● Tamaño inferior a células eucariotas ● Diferentes formas: icosaédrica, helicoidal, esférica, filamentosa,... ● Necesidad de reproducción en el interior de otro organismo ● Carecen de metabolismo celular Estructura: ● Genoma viral: único tipo de ácido nucleico (DNA o RNA) ● Cápside: cubierta proteica que envuelve al genoma ● (Envoltura membranosa): doble capa lipídica con glucoproteínas, NO SIEMPRE
Estructuras relacionadas: ● Espícula de glicoproteína (Proteína Spike, S): interacciona con receptores específicos (ACE2) de la membrana de células humanas. ● Proteína E: ayuda a infectar otras células, posibilitando difusión del virus ● Proteína M: unida a la parte inferior de la membrana vírica y ayuda en su curvatura → forma esférica ● Dímero hemaglutinina-esterasa (HE): une el virus a la célula infectada ● Envuelta membranosa lipídica: protege al virus y ayuda en su transporte por el interior de nuestro organismo ● Cápsida helicoidal: contiene ssARN (+) y Proteínas N (camuflan virus para que el SI no lo detecte)
4. ORGÁNULOS EN LA CÉLULA EUCARIOTA
Diferencia entre citosol y citoplasma: Citosol: dentro de membrana celular y en el citoplasma Citoplasma: citosol + orgánulos
Transporte de proteínas en la célula: ● Retículo endoplasmático liso y rugoso ● Aparato de Golgi ● Lisosomas
4.1 MEMBRANA PLASMÁTICA: bicapa lipídica impermeable (proteínas y lípidos) Función: ● Límite entre el medio extracelular y el interior celular ● Filtro selectivo del paso de sustancias que entran y salen Composición: ● Proteínas: ○ P. transmembrana: expuestas a ambos lados ○ P. periféricas: se asocian con la membrana a través de interacciones P-P ● Lípidos: ○ Fosfolípidos: fosfatidilcolina, fosfatidilserina,... ○ Glicolípidos ○ Colesterol Modelo de mosaico fluido: disposición de L y P que permite movimientos de translación en la bicapa → libre movimiento menos de cara interna a cara externa y viceversa.
4.2 NÚCLEO
Composición: ● Membrana nuclear: bicapa lipídica selectiva entre el núcleo del citoplasma ○ M.N. Externa: continuidad RER ○ M.N. Interna: lámina nuclear ● Poro nuclear: canal de proteínas para intercambio de moléculas ● Nucleolo: transcribe y ensambla cromosomas ● Cromatina: DNA + histonas (P asociadas) ● Nucleoplasma: citosol nuclear con enzimas y proteínas metabólicas de los ácidos nucleicos.
Funciones: ● Duplicación del DNA: DNA → 2x DNA ● Transcripción del DNA: DNa → pre-mRNA ● Procesamiento del mRNA: Pre-mRNA → mRNA ****Traducción (mRNA → P) ocurre en los ribosomas
Transporte a través del poro nuclear: ● Transporte de proteínas ○ Importina: proteínas al interior del núcleo ○ Exportina: proteínas al exterior del núcleo ● Transporte de RNAs: para la traducción ○ Exportina: proteína implicada
4.3 RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO: sistema de endomembranas, con membrana, asociado a la membrana nuclear
4.4 RE LISO: NO asociado a ribosomas, implicado en síntesis y metabolismo de lípidos Muy desarrollado en células musculares estriadas y hepatocitos (síntesis de lípidos) Funciones: ● Síntesis de lípidos : fosfolípidos, colesterol y lípidos de MC ● Contracción muscular : liberación de calcio ● Detoxificación
4.5 RE RUGOSO: asociado a ribosomas → síntesis de proteínas (traducción) Muy desarrollado en células pancreáticas y otras secretoras (por su alta síntesis de P) Funciones: ● Síntesis y almacenamiento de proteínas ● Glicosilación de proteínas : modificación postraduccional ● Control de calidad de proteínas
Tipos de digestión de los lisosomas: ● Digestión extracelular ● Digestión intracelular ○ Autofagia: digestión de material de la propia célula ○ Heterofagia: digestión de material externo (endocitosis y fagocitosis)
4.9 PEROXISOMAS: pequeñas vesículas con membrana Composición: ● Enzimas oxidasas (capaces de eliminar H2O2 ej: catalasa ) Función: ● Degradación de AA y AG ● Síntesis de lípidos ej: colesterol ● Síntesis hepática de ácidos biliare s
4.10 MITOCONDRIAS: condrioma (conjunto de estas) Estructura: ● Doble membrana ○ Membrana externa: permeable ○ Membrana interna: proteico ■ Crestas ● Espacio intermembrana ● Matriz: proteínas y material genético (mtDNA)
Funciones: ● Degradación de AG (Beta-oxidación) ● Ciclo de Krebs ● Fosforilación oxidativa (cadena de transporte de electrones) ● Obtención de energía (ATP) ● Almacenamiento de calcio
DNA mitocondrial: material genético propio de la mitocondria ● Circular ● Genoma mitocondrial humano codifica para 13 proteínas → transporte de e- y fosforilación oxidativa ● TODAS las mitocondrias de un óvulo fecundado son aportados por el oocito (precursor inmaduro del óvulo)
TEMA 3: CICLO CELULAR
Función: duplicación de DNA y distribución de las copias en 2 células hijas genéticamente iguales. Fases:
1. INTERFASE ● Fase G1: post-mitosis ○ Aumento de tamaño ○ Síntesis de RNA y proteínas ● Fase S: ○ Duplicación de DNA ○ Duplicación del centrosoma ● Fase G2: pre-mitosis ○ DNA duplicado ○ Síntesis de RNA y proteínas ● Fase G0: ○ Senescencia (envejecimiento) ○ Quiescencia (inactivo) ○ Apoptosis
DUPLICACIÓN DEL DNA: proceso bidireccional y semidiscontinuo Tipos: ● Proceso semiconservativo: cada cadena doble de DNA contiene una cadena original ● Proceso semi discontinuo: debido a la exclusividad del sentido de amplificación de la DNA polimerasa ● Proceso bidireccional: debido a Okazaki, duplicación en 2 sentidos, múltiples orígenes de replicación
CROMOSOMAS
2.1 MITOSIS
2.1.1. Profase: ● Visibilidad de cromosomas condensados ● Migración de centrosomas a polos opuestos de la célula ● Formación huso mitótico (microtúbulos)
2.1.2. Prometafase: ● Desaparición de envoltura nuclear ● Unión de cromosomas con huso mitótico mediante su cinetocoro ● Movimiento activo
2.1.3. Metafase: ● Alineación de cromosomas en el ecuador del huso mitótico ● Unión de cromátidas hermanas con huso mitótico
2.1.4. Anafase: ● Separación de cromátidas hermanas hacia polo del huso ● Separación de polos → aumento celular
2.1.5. Telofase: ● Llegada de los 2 grupos de cromosomas ● Construcción de nueva envoltura nuclear ● Descomposición de huso mitótico
2.2 CITOCINESIS:
● División del citoplasma en 2 mediante anillo contráctil (estrangula célula) → formación de 2 células hijas (cada una con su núcleo)
3. REGULACIÓN DEL CICLO CELULAR
3.1 PUNTOS DE CONTROL
G1: comprobación de si el medio es favorable para su proliferación (nutrientes y moléculas de señalización) G2: comprobación de que el DNa se haya duplicado y que no haya daños M: comprobación de que cromosomas están unidos al huso mitótico
3.2 ENCARGADOS DE LLEVAR A CABO LOS PUNTOS DE CONTROL CDKs (quinasas dependientes de ciclinas): proteínas clave que deciden si el ciclo continúa o no, dependiendo del estado en el que se encuentre. ➔ Si las CDKs están activas: el ciclo sigue, producen cascadas de señalización intracelular. En la célula nada ocurre sin una causa. Una molécula da la señal a la otra y así sucesivamente. Las células se fosforilan. Se llega a una proteína final que es la que está implicada en la continuidad del ciclo celular. Si se activan estas proteínas, el ciclo progresa. ➔ Si las CDKS están inactivas: el ciclo no continuará. Las CDKs están activas o inactivas según otros reguladores:
Regulación de la actividad de las CDKs: ● Ciclinas: proteínas que varían su concentración de forma cíclica. Las CDKs han de estar unidas a ellas para ser activas ● Quinasa: enzima que fosforila, coge un grupo fosfato y lo pasa a otra molécula. ● Fosfatasa: le quita el grupo fosfato a una molécula que lo tiene. ● CDKI: inhibidores de las CDKs. Proteínas que se unen a las CDKs compitiendo por su unión a las ciclinas. bloquean el ensamblaje o actividad de 1 o + complejos ciclina-CDK, mediante su unión. Pueden ser clasificados como genes supresores tumorales. Proporcionan un enlace con otras vías de regulación de proliferación, diferenciación y senescencia La CDK necesita que su ciclina correspondiente esté presente. La CDK tiene 2 posibles sitios donde ser fosforilada, uno de esos sitios la inhibe y el otro, la activa.
Señales externas que controlan el ciclo celular: ● Factores de crecimiento: Activadores o inhibidores. Intervienen en el control de la síntesis/degradación de proteínas en el interior de la célula y por tanto también en su tamaño ● Mitógenos: Sustancias que promueven la división celular. Actúan sobre los mecanismos internos que regulan el ciclo celular. ● Proteína p53: guardiana del genoma. Impide que el DNA dañado se duplique. Se trata de un gen supresor de tumores (como la proteína del retinoblastoma)
