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Técnicas Moleculares
31/01/
En la centrifugación isopícnica se forma un gradiente por el que circulan las muestras. Da muy buenos resultados pero es una metodología muy larga y no se usa demasiado en los laboratorios. Se suele usar para aislar ácidos nucleicos muy concretos. Además, las sales que se usan en el gradiente pueden desestabilizar algunos ácidos nucleicos.
Al comenzar la centrifugación se formaría el gradiente y las moléculas se van moviendo. Si la partícula está rodeada en un medio con menos densidad, las moléculas se irán al fondo, y así se separan las moléculas por densidades.
EtBr-> Bromuro de etilio. Es un agente intercalante que se coloca entre las bases del DNA. El DNA superenrollado está más compactado que el DNA lineal, por tanto el EtBr tendrá más difícil el colocarse entre las bases, entonces la densidad será mayor. El grado de superenrollamiento influye en la cantidad de EtBr que puede unir. Al unirse entre las bases nitrogenadas la estructura será menos compacta y por tanto menos densa. Así podemos separar las muestras por densidades. Para retirar el EtBr haríamos un fraccionamiento con butanol, y después diálisis para eliminar las sales, el cloruro de cesio.
Extracción de ácidos nucleicos en fase sólida (Celia)
La matriz de vidrio, en presencia de sales caotrópicas, reaccionan con el DNA, las únicas moléculas que van a quedar pegadas en la membrana de sílice son los ácidos nucleicos. (Celia)
Existen algunos especializados en DNA y otros especializados en RNA.
En la purificación basada en interacciones magnéticas introducimos buffer de lisis, se agita y se produce la lisis, después las partículas esféricas reaccionan con el DNA y para separarlas se utiliza una banda magnética, porque las partículas esféricas son magnéticas.
Para diluir se cambian las condiciones del tampón.
Análisis de los ácidos nucleicos aislados
Tras extraerlos, hay que ver que los AN tienen la calidad y cantidad adecuada para lo que queremos hacer con ellos. Para ello tenemos 2 herramientas: técnicas electroforéticas y espectrofotometría.
Electroforesis en gel de agarosa:
Medimos la calidad de los AN. Si sale una banda definida la calidad es buena, si sale algo emborronado significa que el DNA está degradado. Es la única forma de ver si el DNA está en buen estado o no.
Técnicas espectrofotométricas:
Mide la concentración de DNA que tenemos. Estas medidas están estandarizadas (PDF). También se mide el ratio A260/280. A280 mide las proteínas, por lo que el ratio es si está contaminado el DNA con proteínas o no. También son medidas estandarizadas (PDF).
En ocasiones, en las muestras quedan restos de etanol, por lo que también se mide la A230 para ver si quedan restos, ya que absorben alcoholes y compuestos fenólicos.
También existen determinados equipos que permiten medir la concentración de AN por medio de fluorescencia, son más caros pero dan mejores resultados. Se utiliza en pocas ocasiones.
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS
La metodología es bastante diferente respecto a la de extracción de AN. Tras el cultivo, el resto de pasos no se hacen en condiciones estériles. Necesitamos también un tampón de extracción. Se suelen usar tampones Tris o fosfato.
Los antioxidantes más usados son el DTT y B-ME. En ocasiones, si se quiere purificar una proteína poco estable o con una concentración muy baja se pueden usar inhibidores de proteasas para mantenerla estable. Para favorecer la estabilidad de la proteína se usa también sustratos de una enzima o cofactores. El más común es el NADH en las deshidrogenasas.
Las células las tendríamos intactas y resuspendidas en un tampón con las características anteriores (PDF). Ahora tenemos que romper las células para purificar las proteínas. Hay diferentes métodos. En cuanto a los tampones, hay que diferenciar si las proteínas son cituplasmáticas o de membrana, si son de membrana tendrán un tratamiento diferente. Las extrínsecas o periféricas son fáciles de separar de la membrana, se podrían aislar con un tampón sin características especiales, pero las intrínsecas son hidrofóbicas y si nuestro tampón tiene base de agua no la vamos a poder sacar, lo que se hace en ese caso es usar detergentes y extraerlas en forma de micelas. Los más comunes son el SDS (carga+) y el CTAB (carga-). Es más engorroso porque los detergentes forman espumas, son más densos, y puede dificultar su purificación posterior.
Para romper las células hay mecanismos químicos, físicos y enzimáticos
Mecanismos físicos
(CUADRO PDF)
Mecanismos enzimáticos
Es muy frecuente por ejemplo usar una lisozima con un mecanismo físico.
Para determinar la concentración de proteína podemos usa…
El extracto crudo es
Cuando una proteína precipita suele cambiar su estructura, por lo que si nos interesa una proteína que ha precipitado por lo general no podremos volver a recuperarla.
Tema 2
Vamos a ver diferentes técnicas electroforéticas, sobre todo en cuanto a proteínas. Las técnicas electroforéticas se utilizan para separar moléculas cargadas en un campo eléctrico.
La movilidad electroforética (U) es la velocidad de migración de las moléculas por unidad de campo aplicado y es característica de cada molécula. Puede depender de 3 características de la muestra:
depositarla en el pocillo. Necesitamos añadir un marcador ya que los geles con transparentes. El más utilizado es el Azul de Bromofenol.
Si en la electroforesis tenemos una sola banda, no podemos asegurar que la proteína esté purificada porque puede estar asociada a otra con el mismo tamaño que vaya a la misma velocidad.
Electroforesis en condiciones desnaturalizantes
Tenemos que recurrir a un agente desnaturalizante, que será un detergente SDS. Todo va a llevar SDS. Es un detergente aniónico y tiene la característica de que se une a los aa con una relación muy establecida, de forma que se nos une una molécula de SDS por cada 2 aa. La carga que posee la propia proteína se enmascara por el SDS por lo cual todas las proteínas tendrían carga negativa.
M -> masa
U -> movilidad electroforética
21/02/
Tema 7
Para clonar un gen son necesarios 6 pasos:
- Preparar el ADN genómico o ADNc (copia o complementario, copia en ADN de un ARNm). El fragmento del gen o de ADN se aísla. Se puede amplificar por PCR.
- Preparamos el vector.
- Unimos el ADN al vector.
- PDF
- Preparar el inserto. Tenemos dos tipos, o bien el de ADNc o bien el de ADN genómico. Es interesante clonar el ADNc porque al venir del ARNm no tiene intrones.
La mutagénesis dirigida es la mutagénesis donde nosotros decidimos qué residuo…
La PCR puede servir para hacer la mutagénesis dirigida. Necesitamos conocer la secuencia del gen. Se necesitan dos cebadores, 1 y 2, y una pareja de cebadores adicional que serían los cebadores mutagénicos. Estos 3 cebadores tienen que ser solapantes porque…
Maria pibon saluda a la afición
30/03/
Tema 4
Las moléculas vuelven a su estado fundamental tras la excitación. Pueden volver a este estado perdiendo esta energía en forma de calor o pueden llevar una emisión de luz que puede ser fluorescencia o fosforescencia. El estado fundamental es el singlete fundamental (δ0) y tenemos el singlete excitado (δ1) y el triplete (T). La pérdida de energía en forma no radiativa es en forma de calor y hay 3 tipos:
- R: relajación vibracional y rotacional, se baja a un modo vibracional de menor energía pero está siempre dentro del mismo estado excitado. Así, la molécula tiene cada vez un contenido energético menor.
- CI: conversión interna, se produce un cambio del estado singlete excitado al estado singlete fundamental. Es un cambio isoenergético.
- CES: cruce entre sistemas, se produce desde un estado singlete a uno triplete o viceversa. Es una transición isoenergética.
Nos interesan las energías radiativas porque son las que conllevan una emisión de luz porque la energía se pierde en forma de protones. Se pasa de un estado energético superior en un estado excitado a un estado energético inferior en el estado fundamental.
- Fluorescencia: prácticamente inmediato
- Fosforescencia: más lenta y menos probable
Un fluoróforo es una molécula capaz de absorber energía y de excitarse y que cuando se desexcite emita energía en forma de fotones.
Un cromóforo es una molécula que absorbe energía y que pasa de su estado fundamental al excitado pero al desexcitarse no emite energía en forma de fotones.
El valor del rendimiento cuántico siempre estará entre 0 y 1 porque no se pueden emitir más fotones de los absorbidos.
Para hacer un espectro de emisión hay que excitar a la molécula para luego ver su desexcitación. El espectro de emisión es la imagen especular del espectro de absorción desplazado hacia el rojo, es decir, hacia una longitud de onda mayor.
Tenemos una molécula que tiene un fluoróforo y conocemos su expectro de absorción. Excitamos al fluoróforo a una longitud de onda, obtenemos un expectro de emisión, luego lo hacemos a otra longitud de onda y obtenemos otro, y nos fijamos en una sola longitud de onda y representamos el valor de intensidad de fluorescencia frente a la longitud de onda de excitación.
Espectrofluorímetros
Mide la fluorescencia. Tenemos una fuente que es una lámpara más potente que la del espectrofotómetro, de mercurio o xenón. La cubeta tiene las 4 caras transparentes porque la fluorescencia se emite en todas direcciones. El detector se encuentra bajo la cubeta, con un ángulo de 90º para no absorber los fotones que no sean de la muestra ya que si se pone detrás podría absorber la luz de la lámpara.
